硫化氫干預(yù)對(duì)小鼠心肌纖維化MAPK通路表達(dá)的影響

周 茜 張敏芳 任海燕 喬慧瑛

(蘇州市吳江區(qū)第一人民醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科,江蘇 蘇州 215200)

心肌纖維化(MF)是指在心肌的正常組織結(jié)構(gòu)中細(xì)胞外基質(zhì)過量積聚，心臟組織中膠原濃度顯著增高導(dǎo)致間質(zhì)纖維成分增多或心肌細(xì)胞死亡從而被纖維組織替代〔1.2〕。硫化氫(H2S)是一種具有臭雞蛋氣味的氣體，在人體參與調(diào)節(jié)機(jī)體許多生理和病理過程，具有抗炎、抗凋亡和抗氧化作用〔3，4〕。研究顯示H2S可改善大鼠心肌纖維化，減少缺血再灌注相關(guān)的心律失常，可見H2S可改善心肌損傷〔5，6〕。心肌纖維化發(fā)生發(fā)展的過程均與絲裂素活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路的激活有關(guān)，本文探討H2S是否影響心肌纖維化發(fā)生時(shí)MAPK通路。

1 材料與方法

1.1受試動(dòng)物 BALB/c 雌性小鼠，體重18～22 g，6周齡，由新疆醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物依照3R原則，處理動(dòng)物符合動(dòng)物倫理學(xué)要求。

1.2心肌纖維化小鼠模型的制備 取BALB/c 雌性小鼠腹部皮下注射異丙腎上腺素，劑量50 mg/kg，2次/d，連續(xù)10 d。

1.3分組及給藥 取正常BALB/c 雌性小鼠15只，連續(xù)腹部皮下注射生理鹽水10 d，另取45只心肌纖維化小鼠，分為化模型組、H2S高和低劑量組。連續(xù)給藥8 w。

1.4指標(biāo)檢測(cè)

1.4.1體表心電圖 麻醉小鼠，行體表心電圖分析。采用 Nihon Kohden ECG-6511 單道心電圖機(jī)(上海光電)接上肢體導(dǎo)聯(lián)，記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖。

1.4.2組織病理學(xué) 治療后，戊巴比妥鈉麻醉小鼠，下腔靜脈取血，分離血清待測(cè)。冰上分離心臟，稱重，分2份，1份甲醛固定，石蠟包埋，切片，行HE染色，觀察病理，1份-70℃?zhèn)溆眠M(jìn)行Western印跡檢測(cè)。

1.4.3Western印跡檢測(cè) JNK、ERK、p90RSK和p38磷酸化水平的表達(dá)加入1%苯甲基磺酰氟(PMSF)的RIPA裂解液低溫裂解5 min，離心得總蛋白。以二喹啉甲酸(BCA)法檢測(cè)蛋白濃度，電泳，上樣，電轉(zhuǎn)印，PBS-T室溫封閉。應(yīng)激活化蛋白激酶(JNK)(1∶1 000)、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)的蛋白激酶(ERK)(1∶1 500)、p90RSK(1∶800)、p38(1∶500)，GAPDH(1∶1 000)為內(nèi)參；一抗孵育結(jié)束后，取出硝酸纖維素膜(NC膜)，放TBST于搖床洗滌，洗完進(jìn)行二抗(1∶10 000)室溫孵育1.0 h。在暗室中電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色，曝光、條帶半定量分析。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行t及χ2檢驗(yàn)，方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組體重、心臟重量和心臟系數(shù)比較 與正常組比較，模型組體重明顯降低(P<0.05)，心臟重量和心臟系數(shù)明顯增高(P<0.05)，與模型組比較，H2S組體重明顯增高(P<0.05)，心臟重量降低和心臟系數(shù)明顯降低(P<0.05)，且呈劑量依賴性。見表1。

2.2各組心電圖比較 與正常組比，模型組ST段明顯抬高(P<0.05)，H2S組ST段明顯降低(P<0.05)，見圖1。

2.3各組心肌病理學(xué)觀察 正常組心肌細(xì)胞正常，模型組心肌細(xì)胞肥大、腫脹，變性，部分溶解或壞死，肌原纖維扭曲，斷裂，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。H2S低劑量組大部分病灶均被吸收，少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，增生的纖維組織和肌原纖維溶解，H2S高劑量改善明顯，見圖2。

2.4各組心肌JNK表達(dá)比較 與正常組比較，模型組JNK明顯增高，與模型組比較，H2S組JNK明顯降低，且呈劑量依賴性，見表2，圖3。

表1 各組體重、心臟重量和心臟系數(shù)比較

與正常組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05；與H2S低劑量組比較：3)P<0.05，下表同

圖1 各組治療心電圖比較

圖2 各組心肌病理學(xué)觀察(HE，×200)

組別JNKERKp90RSKp38正常組0.4±0.21.0±0.50.4±0.10.3±0.2模型組0.9±0.21)0.2±0.11)0.3±0.11)0.9±0.21)H2S低劑量組0.5±0.22)0.4±0.12)0.6±0.22)0.6±0.22)H2S高劑量組0.3±0.12)3)0.6±0.22)3)0.9±0.32)3)0.4±0.12)3)F/P值31.923/0.00022.581/0.00028.000/0.00032.308/0.000

2.5各組心肌ERK表達(dá)比較 與正常組比較，模型組ERK明顯降低，與模型組比較，H2S組ERK明顯升高，且呈劑量依賴性，見表2，圖4。

2.6各組心肌p90RSK表達(dá)比較 與正常組比較，模型組p90RSK明顯降低，與模型組比較，H2S組p90RSK明顯升高，且呈劑量依賴性(均P<0.05)，見表2，圖5。

2.7各組心肌p38表達(dá)比較 與正常組比較，模型組p38明顯增高，與模型組比較，H2S組的p38明顯降低，且呈劑量依賴性(均P<0.05)。見表2，圖6。

1～4：正常組，模型組，H2S低劑量組，H2S高劑量組，下圖同圖3 各組心肌JNK表達(dá)

圖4 各組心肌ERK表達(dá)

圖5 各組心肌p90RSK表達(dá)

圖6 各組小鼠治療后心肌p38磷酸化表達(dá)的比較

3 討 論

心肌纖維化的病理機(jī)制較為復(fù)雜，涉及多種細(xì)胞信號(hào)通路引起細(xì)胞凋亡，其中MAPK 細(xì)胞信號(hào)途徑是此過程中誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷致凋亡中的一個(gè)重要調(diào)節(jié)樞紐，是多種細(xì)胞外信號(hào)引起細(xì)胞增殖、肥大和纖維化的細(xì)胞內(nèi)信息共同通路〔7〕。動(dòng)物研究也證實(shí)心肌纖維大鼠的MAPK活性顯著高于同齡健康大鼠〔8〕。

MAPK通路容易被心肌纖維化、缺血再灌注損傷和細(xì)胞因子等刺激性病理因素激活。MAPK分為3 個(gè)亞族：ERK、JNK和p38〔9，10〕。其中，ERK 具有心肌保護(hù)作用。ERK 過度表達(dá)可抑制大鼠的心肌凋亡能力，激活的 ERK 信號(hào)級(jí)聯(lián)可消除缺血再灌注損傷所致的心肌細(xì)胞損傷及凋亡。ERK 的下游效應(yīng)器承擔(dān)ERK的抗凋亡功能，如 ERK 能夠直接磷酸化且激活 p90RSK，激活的 p90RSK能在線粒體順序化磷酸化親凋亡因子 Bad，保護(hù)細(xì)胞避免凋亡。JNK和p38蛋白激酶被激活后引起特定蛋白的表達(dá)或活性改變，參與細(xì)胞的基因表達(dá)、遷移、分化、凋亡和增殖調(diào)控作用，可導(dǎo)致多種器官的細(xì)胞凋亡。嚙鼠動(dòng)物的研究顯示p38在缺血再灌注損傷的心肌細(xì)胞促凋亡方面具有關(guān)鍵作用，小鼠心肌缺血前給予p38的特異性抑制劑SB239063，可顯著降低心肌梗死面積，但JNK在調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞凋亡的效應(yīng)仍存在爭(zhēng)議，與JNK可調(diào)節(jié)不同細(xì)胞因子發(fā)揮促進(jìn)或抑制細(xì)胞凋亡的作用〔11～13〕。由此可見，MAPK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的逐級(jí)激活可能是血管平滑肌細(xì)胞增殖和心肌纖維化的重要機(jī)制。

H2S對(duì)心肌保護(hù)作用受到關(guān)注，離體心肌梗死模型的研究顯示，H2S可顯著縮小梗死心肌面積并降低心肌梗死后死亡率，提示H2S可能對(duì)缺血缺氧心臟起著保護(hù)性作用。H2S對(duì)主動(dòng)脈及肺動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞具有抑制增殖和促進(jìn)凋亡的雙重作用。對(duì)于體外培養(yǎng)的大鼠主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞，內(nèi)皮素可誘導(dǎo)其增殖并使MAPK活性增加，而H2S可劑量依賴性地下調(diào)MAPK從而抑制內(nèi)皮素誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖〔14～17〕。

本文顯示，H2S能夠抑制MAPK通路激活，即促進(jìn) MAPK的ERK 的活化和減少促凋亡通路JNK和p38通路的激活，起到減輕心肌纖維化的藥效，具有明顯的心肌靶器官保護(hù)作用，但課題仍存在一些問題：①JNK的抗心肌細(xì)胞凋亡的作用仍處于爭(zhēng)議狀態(tài)，②p38信號(hào)通路與細(xì)胞外的應(yīng)激性刺激相關(guān)，其中一個(gè)因素為高滲，而H2S的干預(yù)是否也影響體液滲透壓，這一點(diǎn)本課題并未考察，③H2S的藥理作用是否還涉及其他作用靶點(diǎn)和通路還需進(jìn)一步研究。