三氧化二砷聯合白藜蘆醇對肺癌細胞侵襲、遷移的影響及機制

郭天利 李宏健 龐 慧 焦同立 李春艷 于法明

(焦作市第二人民醫院腫瘤內科，河南 焦作 454001)

三氧化二砷(As2O3)是一種劇毒，但在治療疾病方面具有重要作用，如治療急性早幼粒白血病具有較好的療效〔1〕。近年來的研究顯示，As2O3具有抑制腫瘤生長的能力，對多種腫瘤如肝癌〔2〕、肺癌〔3〕、胃癌〔4〕、結腸癌〔5〕等均發揮一定的抑制作用。但在臨床應用中發現，As2O3濃度過高會對機體產生嚴重的毒副作用〔6〕。因此，為了減少As2O3的毒副作用及提高其作用效果，臨床上常采取聯合用藥的方式。白藜蘆醇是一種分布范圍較廣的天然多酚，能通過多種方式調節惡性腫瘤細胞的增殖、凋亡及侵襲，是一種高效預防腫瘤的藥物。研究發現，As2O3聯合白藜蘆醇可增強其誘導細胞凋亡的能力，從而抑制腫瘤的發展〔7,8〕。但關于二者聯合使用對肺癌細胞侵襲、遷移的相關作用及機制的研究較少。本研究旨在觀察As2O3聯合白藜蘆醇對肺癌細胞侵襲、遷移能力的影響，并探究其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1材料 人肺癌細胞系A549購自中科院上海細胞庫，As2O3購自北京雙鷺藥業有限公司，白藜蘆醇、Matrigel膠購自美國Sigma公司，DMEM培養基購自美國Gibco公司，胎牛血清、胰酶(含EDTA)購自美國Hyelone公司，四甲基偶氮唑鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)購自美國Amresco公司，Transwell小室購自美國Corning公司，細胞裂解液及聚氨基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白濃度檢測試劑盒購自上海碧云天公司，β肌動蛋白(actin)抗體、基質金屬蛋白酶(MMP)-2抗體、MMP-9抗體購自武漢博士德公司，辣根過氧化物酶標記(HRP)的山羊抗兔二抗購自北京康為公司，波形蛋白(Vimentin)抗體、鈣黏蛋白E(E-cadherin)抗體購自美國Cellular Signaling Technology公司。細胞培養箱購自上海生物儀器廠，酶標儀購自美國寶特公司，凝膠成像系統購自英國Syngene公司。

1.2細胞的培養與處理 肺癌A549細胞培養于DMEM培養基，培養基中包含10%胎牛血清及1%的青-鏈霉素，置于37℃、5%CO2、飽和濕度下培養，每2 d更換一次培養基，每3 d傳代一次。取生長狀態良好的細胞加入不同濃度白藜蘆醇聯合10 μmol/L As2O3進行處理24 h，對照組加入無血清培養基。

1.3MTT法檢測細胞增殖活性 以每孔1×104個細胞接種于96孔板上，待細胞貼壁后，加入不同濃度白藜蘆醇(15、30、60、120 μmol/L)進行干預，37℃培養箱中培養48 h后，每孔加入100 μl MTT(5 mg/ml)，37℃避光培養4 h；棄去孔內液體，每孔加入100 μl DMSO，室溫振蕩5 min，酶標儀中檢測570 nm波長下吸光值OD570 nm。計算細胞的存活率：細胞存活率(%)=實驗組OD570 nm/對照組OD570 nm×100%。

1.4劃痕實驗 實驗前48 h，將各組細胞濃度調整為5×105/ml，接種于6孔板中，加入60 μmol/L白藜蘆醇聯合10 μmol/L As2O3處理細胞，培養24 h后，待細胞的密度約為90%時，使用無血清的培養基饑餓培養24 h，采用20 μl無菌槍頭在細胞層中快速劃1～2道痕。吸出上清，無菌的磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細胞并更換為含胎牛血清的培養基，記錄細胞0 h和24 h的距離，每組設5個重復，取平均值。

1.5細胞遷移、侵襲實驗 將-20℃冰箱中的Matrigel膠放入4℃冰箱中過夜，與9倍體積的無血清培養基混勻。吸取50 μl Matrigel膠稀釋液加入Transwell上室底部，37℃孵育3 h。收集各組細胞，使用含血清的培養基培養12 h，調整為1×104個細胞和200 μl加入Transwell上室，下室加入500 μl含10%胎牛血清的培養基，37℃培養24 h；1倍PBS清洗上室，濕棉簽擦盡殘留細胞，1%多聚甲醛固定10 min，結晶紫染色，37℃孵育5 min，顯微鏡下拍照、計數，取5個視野的平均值。遷移實驗過程中，Transwell上室底部不加入Matrigel膠稀釋液，其余步驟與侵襲相同。

1.6細胞中MMP-2、MMP-9及上皮間充質轉化(EMT)蛋白的變化 收集對照組、60 μmol/L白藜蘆醇和10 μmol/L As2O3處理的細胞，加入細胞裂解液，冰上裂解30 min，離心，吸取上清，采用BCA法檢測蛋白濃度。配置適宜的分離膠和濃縮膠，吸取50 μg蛋白樣品，進行電泳、轉膜；5%脫脂奶粉封閉1 h；加入一抗，4℃孵育過夜，加入相應二抗，37℃孵育2 h，加入ECL液顯色，凝膠成像系統中拍照，Quantity One分析與內參β-actin的灰度值比值，表示目的蛋白的相對表達量。

1.7統計學分析 采用SPSS22.0軟件，多組計量數據間的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較使用LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1As2O3聯合白藜蘆醇對肺癌A549細胞增殖的影響 不同濃度的白藜蘆醇作用于肺癌A549細胞，48 h后細胞的存活率〔15、30、60、120 μmol/L白藜蘆醇組細胞存活率分別為(89.254±5.749)%，(72.369±3.687)%，(52.967±4.584)%，(38.214±2.457)%〕較對照組〔(100.003±0.008)%〕顯著降低(P<0.05)；隨著白藜蘆醇藥物濃度的增加，細胞的存活率逐漸降低(P<0.05)。統計學分析顯示，白藜蘆醇的半數抑制濃度(IC50)為58.367 μmol/L。因此后續實驗中，以60 μmol/L白藜蘆醇作為實驗濃度。

2.2As2O3聯合白藜蘆醇對肺癌A549細胞遷移的影響 與對照組相比，10 μmol/L As2O3和60 μmol/L白藜蘆醇單獨作用于A549細胞時，細胞的修復速度和遷移細胞數顯著降低(P<0.05)，但二者間差異無統計學意義(P>0.05)；與As2O310 μmol/L組和白藜蘆醇60 μmol/L組相比，As2O3+白藜蘆醇組細胞的修復速度和遷移細胞數顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 As2O3聯合白藜蘆醇對肺癌A549細胞遷移的影響

與對照組相比：1)P<0.05；與As2O310 μmol/L相比：2)P<0.05；與白藜蘆醇60 μmol/L相比：3)P<0.05；下表同

2.3As2O3聯合白藜蘆醇對肺癌A549細胞侵襲的影響 與對照組〔(115.32±16.478)個〕相比，10 μmol/L As2O3和60 μmol/L白藜蘆醇單獨作用于A549細胞時，細胞的侵襲細胞數〔(82.412±9.587)個，(79.368±8.789)個；P<0.05〕顯著降低；二者單獨使用時細胞的侵襲細胞數差異無統計學意義(P>0.05)；與As2O310 μmol/L組和白藜蘆醇60 μmol/L組相比，As2O3+白藜蘆醇組細胞的侵襲細胞數顯著降低〔35.269±5.784)個，P<0.05〕。

2.4As2O3聯合白藜蘆醇對肺癌A549細胞中MMP-2、MMP-9及EMT蛋白的影響 與對照組相比，10 μmol/L As2O3和60 μmol/L白藜蘆醇單獨作用于A549細胞時，細胞中MMP-2、MMP-9蛋白水平顯著降低(P<0.05)，下調Vimentin蛋白(P<0.05)，上調E-cadherin蛋白(P<0.05)；與As2O310 μmol/L組和白藜蘆醇60 μmol/L組相比，As2O3+白藜蘆醇組細胞中MMP-2、MMP-9蛋白顯著降低(P<0.05)，抑制Vimentin蛋白表達(P<0.05)，促進E-cadherin蛋白水平(P<0.05)。As2O310 μmol/L組與白藜蘆醇60 μmol/L組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1，表2。

圖1 As2O3聯合白藜蘆醇對肺癌A549細胞中MMP-2、MMP-9及EMT蛋白的影響

組別MMP-2/β-actinMMP-9/β-actinVimentin/β-actinE-cadherin/β-actin對照組0.823±0.0890.653±0.0660.562±0.0570.649±0.068As2O3 10 μmol/L組0.689±0.0751)0.482±0.0451)0.420±0.0431)0.856±0.0821)白藜蘆醇60 μmol/L組0.692±0.0711)0.463±0.0481)0.436±0.0481)0.834±0.0871)As2O3+白藜蘆醇組0.423±0.0451)2)3)0.247±0.0261)2)3)0.215±0.0241)2)3)1.145±0.1691)2)3)

3 討 論

肺癌組織易發生轉移，對常規的化學治療藥物不敏感，是其死亡率較高的主要原因之一。白藜蘆醇是一種天然的多酚類物質，具有很強的生物特性。研究已經證實，白藜蘆醇對多種腫瘤如乳腺癌、子宮內膜癌等具有顯著的預防作用〔9,10〕。As2O3也是近年來研究的相對較多的抗腫瘤藥物。報道顯示，As2O3可作用于Bcl-2家族，從而誘導胃癌細胞的凋亡〔11〕。在人腎母細胞瘤中，As2O3可抑制CyclinD1蛋白的表達量，誘導細胞的凋亡〔12〕。在食管癌中，As2O3能有效抑制細胞的侵襲及血管生成能力，可能與阻礙食管癌細胞間的黏附力及運動能力有關〔13〕。在探究抗腫瘤藥物的聯合使用效果時，常選用10 μmol/L As2O3作為研究對象〔14〕。在本實驗中，不同濃度白藜蘆醇(15、30、60、120 μmol/L)作用于肺癌細胞，隨著濃度的增加，細胞的存活率逐漸降低。

在腫瘤的轉移過程中，細胞外基質黏附作用的改變發揮重要作用。在此過程中，腫瘤細胞會分泌和表達相關蛋白酶如組織蛋白酶、MMPs等，促進組織基質的降解及血管的生成，從而發揮促進腫瘤生長和轉移的作用〔15,16〕，其中以MMP-2、MMP-9蛋白的作用最關鍵〔17〕。此外，EMT過程與腫瘤組織轉移、細胞的分化等密切相關。EMT過程以E-cadherin上皮標志物表達降低、Vimentin等間質標志物表達增加為主要特征。研究發現，發生EMT的腫瘤細胞具有較強的侵襲、遷移能力〔18〕。在胃癌細胞中，As2O3和白藜蘆醇均可通過調控MMP-2、MMP-9蛋白水平參與腫瘤細胞的侵襲、遷移過程〔19,20〕。白藜蘆醇還可調控EMT蛋白表達，抑制EMT，降低食管癌細胞的侵襲、遷移〔21〕。本研究表明，As2O3和白藜蘆醇聯合抑制細胞的侵襲、凋亡與MMPs水平及EMT過程有關。

綜上所述，As2O3和白藜蘆醇聯合使用可增加二者抑制肺癌細胞侵襲、遷移的能力，其可能的作用機制與二者聯合處理進一步降低細胞中MMPs的水平、抑制細胞外基質的降解和EMT過程有關。