美洲大蠊成蟲腸道菌群多樣性分析

郝艷芹， 周闖， 晉家正， 沈詠梅， 張修月， 岳碧松*

(1. 四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室，成都610065；2.藥用美洲大蠊四川省重點實驗室，成都610081)

宿主腸道中微生物群落與其健康相關(guān)，它們能夠與宿主相互協(xié)作增加機體整體適應(yīng)性(張振宇等，2017)。腸道菌群能合成膽汁酸、膽堿以及短鏈脂肪酸等對機體健康有利的代謝產(chǎn)物(Nicholson & Wilson，2003)，微生物還能與宿主代謝互作產(chǎn)生維持宿主正常免疫的代謝產(chǎn)物，如小肽、多胺和甲基供體等(Nicholsonetal.，2012)。

美洲大蠊Periplanetaamericana隸屬于蜚蠊目Blattaria蜚蠊科Blattidae大蠊屬Periplaneta，雜食特性和超強的環(huán)境適應(yīng)能力使其成為研究宿主與腸道菌群間協(xié)同進化關(guān)系的重要模型之一(Mullins，2015)。Ondrejech(2016)以美洲大蠊為模型研究腸道菌群與宿主關(guān)系時發(fā)現(xiàn)，使用抗生素消除腸道菌群后，宿主的代謝速率減緩且體質(zhì)量降低，表明腸道菌群可能為宿主提供必要的營養(yǎng)物質(zhì)。Sabree等(2009)在構(gòu)建美洲大蠊的內(nèi)共生菌——蟑螂桿狀體屬Blattabacterium的消化通路時，發(fā)現(xiàn)內(nèi)共生菌能為宿主提供自身不能合成的氨基酸和維生素等，以提高宿主對營養(yǎng)不均衡食物的利用率。美洲大蠊腸道菌群具有高度多樣性的特征，劉曉飛等(2015)采用體外培養(yǎng)從美洲大蠊成蟲腸道中分離出20種細菌，它們多數(shù)屬于變形桿菌門Proteobacteria和擬桿菌門Bacteroidetes這兩大類昆蟲腸道優(yōu)勢菌門。Bagde等(2013)在研究美洲大蠊成蟲腸道時發(fā)現(xiàn)，可培養(yǎng)細菌不僅有芽孢桿菌屬Bacillus，還有腸桿菌屬Enterobacteria、志賀氏桿菌Shigasbasillus等機會致病菌，還有傷寒沙門氏菌Salmonellatyphi等致病菌。這些研究多集中在腸道菌群功能及它們是否能體外培養(yǎng)等方面，對美洲大蠊成蟲腸道菌群結(jié)構(gòu)的研究較為缺乏。本研究采用16S rRNA高通量測序技術(shù)研究美洲大蠊成蟲腸道菌群多樣性，避免遺漏體外不能分離培養(yǎng)的細菌，以期鑒定出更全面的美洲大蠊腸道菌群群落，深入研究腸道菌群與宿主相互關(guān)系。

1 實驗方法

1.1 實驗材料

實驗采用的美洲大蠊成蟲來源于四川好醫(yī)生攀西藥業(yè)有限責任公司美洲大蠊養(yǎng)殖基地。隨機選取6只成蟲，饑餓24 h，在無菌室用75%乙醇表面消毒30 s，再用無菌水漂洗3次。剪去蟲體的翅膀和腿，用大頭針固定頭部，從背面中部的肛門開始剪開，直到頭部。將整個腸道移到2 mL EP管中，-80 ℃保存(Carrascoetal.，2014)。

1.2 總DNA提取和PCR擴增及測序

混合6個腸道樣品后用液氮研磨。參考十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法提取總DNA(李鈞敏，金則新，2006)。瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度，無菌水稀釋樣品至1 ng·μL-1。使用16S rRNA V4可變區(qū)的通用引物：515F(GTGCCAGCMGCCGCGGTAA)、806R(GGACTACNNGGGTATCTAAT)進行PCR擴增，20 μL體系包括：High-Fidelity PCR Master Mix 10 μL，帶Barcode的特異引物各1 μL，高保真酶0.3 μL，模板DNA 1 μL，剩余部分由ddH2O補齊，反應(yīng)程序為：98 ℃ 1 min；30個循環(huán)(98 ℃ 10 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s)；72 ℃ 5 min。產(chǎn)物送北京諾禾致源科技有限公司用HiSeq PE250平臺測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

參照Qiime(V1.7.0，http：//qiime.org/scripts/split_libraries_fastq.html)的Tags質(zhì)量控制流程對獲得的測序數(shù)據(jù)進行拼接和過濾處理。將處理后的數(shù)據(jù)以97%的一致性利用Uparse(Edgar，2013)全部聚類成操作分類單元(OTUs)。同時選取OTUs的代表性序列，使用Mothur(Wangetal.，2007)與SILVA的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫(Quastetal.，2013)進行物種注釋分析并統(tǒng)計各樣本的菌群組成。

2 結(jié)果

2.1 腸道菌群門水平上的多樣性

通過16S rRNA測序檢測到細菌序列67 492條，歸類為581個OTUs，物種注釋到21個門。腸道的優(yōu)勢菌門為厚壁菌門Firmicutes(56.96%)和擬桿菌門(33.13%)，其后依次為變形桿菌門(6.65%)、放線菌門Actinobacteria(1.11%)和浮霉菌門Planctomycetes(1.03%)等(表1)。

2.2 腸道菌群目水平上的多樣性

從目水平上對美洲大蠊成蟲腸道菌群組成進行分析發(fā)現(xiàn)，相對豐度≥0.1%的目占總目數(shù)的18.99%(15/79)。優(yōu)勢菌目主要為擬桿菌目Bacteroidales(32.11%)、芽孢桿菌目Bacillales(29.89%)、梭菌目Clostridiales(12.93%)和乳桿菌目Lactobacillales(10.73%)(表2)。

2.3 腸道菌群屬水平上的多樣性

對樣品檢測到的所有OTUs序列進行聚類注釋后得到193個屬，其中相對豐度≥0.1%的菌屬有39個。除變形桿菌門的脫硫弧菌屬Desulfovibrio(0.94%)等6個屬、放線菌門的微球菌屬Micrococcus(1.00%)和軟壁菌門Tenericutes的無膽甾原體屬Acholeplasma(0.18%)外，其余31屬均屬于厚壁菌門和擬桿菌門這兩大優(yōu)勢菌門。厚壁菌門中的優(yōu)勢菌屬分別為葡萄球菌屬Staphylococcus(16.59%)、芽孢桿菌屬Bacillus(13.26%)和Lactobacillus(8.92%)；擬桿菌門中的優(yōu)勢菌屬為副桿菌屬Parabacteroides(10.26%)(表3)。

表1 美洲大蠊腸道菌群門類組成Table 1 The intestinal microbiota composition of Periplaneta americana on phylum category

注： 相對豐度=物種有效序列數(shù)/樣本總有效序列數(shù)； 下同

Note： Relative abundance=number of valid sequences of the species/ number of total valid sequencesl； the same below

表2 美洲大蠊腸道菌群目水平相對豐度(≥0.1%)Table 2 The intestinal microbial abundance of Periplaneta americana (≥0.1%)on order category

表3 美洲大蠊腸道菌群屬水平相對豐度(≥0.1%)Table 3 The intestinal microbial abundance of Periplaneta americana (≥0.1%)on genus category

2.4 美洲大蠊腸道優(yōu)勢菌屬中的菌種多樣性

在美洲大蠊成蟲腸道菌群中，共注釋到83種細菌，但由于測序片段較短，數(shù)據(jù)并不可信。統(tǒng)計美洲大蠊排名前5的優(yōu)勢菌屬中注釋到的菌種，葡萄球菌屬中注釋到的松鼠葡萄球菌Staphylococcussciuri(14.95%)是美洲大蠊成蟲腸道中的優(yōu)勢菌種。副桿菌屬中注釋到的菌種為Parabacteroidesmerdae。Lactobacillus中注釋到的菌種為加氏乳桿菌L.gasseri、戊糖乳桿菌L.pentosus、粘膜乳桿菌L.mucosae和動物乳桿菌L.animalis(表4)。

表4 美洲大蠊腸道優(yōu)勢菌屬中的菌種統(tǒng)計Table 4 Statistical analysis of species in the dominant genus of the Periplaneta americana intestinal microbiota

3 討論

美洲大蠊成蟲腸道菌群與其他昆蟲具有一定的相似性，以厚壁菌門、擬桿菌門為主要優(yōu)勢類群(Sabree & Moran，2014；Douglas，2015)，這2個菌門中的許多種類能夠消化纖維素、碳水化合物和蛋白質(zhì)等。例如，厚壁菌門的優(yōu)勢菌屬芽孢桿菌屬和Lactobacillus為發(fā)酵類細菌，它們不僅能夠利用碳水化合物生成乳酸，促進營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，還可以產(chǎn)生細菌素等物質(zhì)抵抗真菌的侵害(Inglinetal.，2015)；擬桿菌門類桿菌屬Bacteroides的大部分細菌擁有水解多糖的酶，能夠把復(fù)雜的多糖轉(zhuǎn)變成簡單的可供宿主利用的營養(yǎng)物質(zhì)(Xuetal.，2007)。除此之外，有研究發(fā)現(xiàn)變形桿菌門的優(yōu)勢菌屬脫硫弧菌屬是存在于人體腸道內(nèi)常見的條件致病菌，它們在無氧條件下可將硫酸鹽還原為對腸道上皮細胞具有毒性作用的硫化物，還可誘導(dǎo)上皮細胞的異常增殖，造成非炎癥性腸病等(Loubinouxetal.，2002)，而其在美洲大蠊腸道中的作用有待進一步研究。放線菌門的許多種類能夠參與宿主的碳氮循環(huán)和抵抗病菌侵染(Flint，2011；張曉杰等，2016)。這些主要優(yōu)勢菌門和其他一些菌屬的存在為美洲大蠊的生長、發(fā)育和繁殖提供了有利的保障。

Bertino-Grimaldi等(2013)對美洲大蠊成蟲腸道菌群研究時發(fā)現(xiàn)，其優(yōu)勢菌門為擬桿菌門和變形桿菌門，這與本研究結(jié)果差異較大。這種差異的產(chǎn)生可能與美洲大蠊的來源有關(guān)，本研究檢測的是人工飼養(yǎng)種群，而Bertino-Grimaldi等(2013)檢測的是野生種群。研究表明，美洲大蠊腸道微生物能夠隨著宿主飲食的改變而改變，當它取食高纖維食料時，厚壁菌門顯著增加(Danielleetal.，2013)，取食高蛋白食料時腸道菌群的豐富性增加(Pérezcobasetal.，2015)。本實驗所采用的樣本為人工飼養(yǎng)種群，其生存條件和攝取的營養(yǎng)物質(zhì)與生活在環(huán)境較為惡劣的下水道等地的野生種群有很大差異，所以與其他研究結(jié)果中優(yōu)勢菌門不一致是合理的。由于16S rRNA高通量測序片段較短，許多序列并不能注釋到種，注釋到種的結(jié)果可信度也不高。因此，只對排名前5的優(yōu)勢菌屬中注釋到的細菌進行了統(tǒng)計。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，優(yōu)勢菌種為葡萄球菌屬的松鼠葡萄球菌，它是一種常見的動物病原菌，不但能引起黃鱔Monopterusalbus、黃喉擬水龜Mauremysmutica等動物感染，還能引起人腦膜炎、尿路等感染(段薈芹，王利，2015)，但它是否會引起人工飼養(yǎng)的美洲大蠊患病尚無研究。Lactobacillus中的戊糖乳桿菌在人類腸道中占優(yōu)勢，能夠幫助宿主降解肉類食物，同時還能夠通過產(chǎn)生過氧化氫來幫助宿主抵抗致病菌的侵染(Tailliez，2004)。據(jù)此推測，它可能為美洲大蠊腸道中的益生菌，但其具體功能有待進一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，美洲大蠊腸道菌群種類豐富，這可能與美洲大蠊適應(yīng)性強、生存力強、食性雜有關(guān)。本研究為美洲大蠊與其腸道菌群之間的關(guān)系研究提供一定的理論參考，也為美洲大蠊的健康養(yǎng)殖提供了新思路。