茶多酚二元醇脂質體的制備及質量評價

宋 娟 于緒東 張振宇 王 棟

茶多酚(Tea-Polyphenol, TP)是茶葉中一類多羥基酚類化合物的總稱，約占茶葉干重的30%。其中兒茶素為TP的主要成分，包括表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、表沒食子兒茶素(EGC)、表兒茶素沒食子酸酯(ECG)和表兒茶素(EC)[1-4]。研究表明，TP對白癜風、紫外線輻射、過敏、痤瘡、保健美容等多種皮膚科疾病有效，在臨床皮膚病治療中具有廣泛的應用前景[5-7]。然而，TP結構中的羥基及沒食子酸極易在光照、高溫、堿性等條件下發生氧化、聚合、縮合等變化，導致其體內外分解快速，穩定性較差，且TP脂溶性弱，皮膚滲透性差的特點，進一步限制了TP在皮膚病治療中的應用[8-11]。

二元醇脂質體(Binary ethosome)是一種新型的柔性脂質體，是Zhou等[12]基于試驗結果對乙醇脂質體改進得到的新型經皮給藥載體，采用二元醇相(包括乙醇和丙二醇)代替單純的乙醇制備的二元醇脂質體，具有生物相容性好、制備工藝簡單、性質穩定、皮膚滲透性及滯留性強等特點[13,14]。若將TP制成二元醇脂質體能夠有效改善TP穩定性及皮膚滲透性差的缺陷。目前，國內外已有關于TP乙醇脂質體的報道，但尚未見TP二元醇脂質體的相關研究，因此，本文采用乙醇和丙二醇組成的混合醇代替單純的乙醇首次制備了TP二元醇脂質體(TP-EL)，并對TP-EL的質量進行評價。

1 材料

1.1 儀器 BS110S型電子天平(賽多利斯科學儀器有限公司)；TU-1901型雙光束紫外可見光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)；JY92-II 型超聲波細胞粉碎機(寧波新芝科器研究所)；LP 220S型電子天平(賽多利斯科學儀器有限公司)；Nano ZS90 粒度儀(英國Malvern 公司)；DF-101S集熱式磁力加熱攪拌器(中國金壇市醫療儀器廠)。

1.2 試劑 茶多酚(無錫市世紀生物工程有限公司，純度為98%)；大豆卵磷脂(北京奧博星生物技術有限公司)；乙醇(大連川連酒廠)；膽固醇(廣州南方化玻公司)；丙二醇(湖南爾康高科藥業有限公司)；酒石酸鉀鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、硫酸亞鐵、甲醇均為分析純。

2 方法

2.1 TP-EL的制備 采用乙醇注入法制備TP-EL。稱取TP、磷脂及膽固醇置于密閉容器中，加入適量的乙醇和丙二醇(體積比為2∶1)混合溶液溶解，隨后置于磁力攪拌器上。在30℃條件下，用注射器將純化水以緩慢細流狀注入至上述溶液中，注完后繼續攪拌適當時間，將得到的水性混懸液超聲后過0.22 μm濾膜，即得TP-EL。

2.2 單因素考察 以TP-EL的包封率為評價指標，對磷脂的濃度、磷脂與膽固醇的比例、藥物與磷脂的比例、制備溫度及攪拌時間進行篩選。

2.2.1 磷脂的濃度 按“2.1 TP-EL的制備”項下方法分別制備磷脂濃度為2%，3%，4%及5%的TP-EL，測定TP-EL的包封率，考察磷脂濃度對TP-EL包封率的影響。

2.2.2 磷脂與膽固醇的比例 按“2.1 TP-EL的制備”項下方法分別制備磷脂與膽固醇的質量比為3∶1、5∶1、10∶1、15∶1 的TP-EL，測定TP-EL的包封率，考察磷脂與膽固醇比例對TP-EL包封率的影響。

2.2.3 藥物與磷脂的比例 按“2.1 TP-EL的制備”項下方法分別制備藥物與磷脂的質量比為1∶2、1∶5、1∶8、1∶10 的TP-EL，測定TP-EL的包封率，考察藥物與磷脂比例對TP-EL包封率的影響。

2.2.4 制備溫度 按“2.1 TP-EL的制備”項下方法分別制備溫度為30℃、40℃、50℃的TP-EL，測定TP-EL的包封率，考察制備溫度對TP-EL包封率的影響。

2.2.5 攪拌時間 按“2.1 TP-EL的制備”項下方法分別制備攪拌時間為5 min、20 min、40 min、60 min的TP-EL，測定TP-EL的包封率，考察攪拌時間對TP-EL包封率的影響。

2.3 正交設計 在單因素考察的基礎上，篩選出影響脂質體包封率的3個因素：磷脂濃度(A)、磷脂與膽固醇的比例(B)、藥脂比(C)。以這3個因素作為主要考察因素，每個因素又選取3個水平(表1)，采用正交設計法 L9(34)進行試驗(表2)，以包封率為評價指標，優化TP-EL的處方。

2.4 TP-EL質量評價

2.4.1 TP-EL的外觀 采用目測法，觀察所制備的TP-EL的外觀。

2.4.2 TP-EL的形態 取TP-EL適量，用水稀釋10倍，用覆有碳膜的銅網沾取少量的樣品溶液，濾紙吸取多余樣品，然后用2%的磷鎢酸溶液負染2 min，染色后的銅網自然晾干，置于透射電子顯微鏡下，觀察TP-EL的形態。

表1 正交設計的因素水平表

表2 正交試驗結果

2.4.3 TP-EL的粒徑及Zeta電位 取TP-EL適量，以水為稀釋介質，用激光粒度測定儀測定TP-EL的粒度及其分布和Zeta電位。

2.4.4 pH值 磷脂易氧化水解，其氧化水解速率受pH值的影響較大，只有在一定的pH范圍內才比較穩定。因此，本文采用PB-10型pH計對TP-EL的pH值進行測定。

2.4.5 TP-EL的包封率 采用超濾-離心法測定TP-EL的包封率。精密量取TP-EL 1 mL置5 mL量瓶中，加純化水稀釋至刻度，搖勻，取稀釋后的樣品，置超濾離心管中(超濾膜截留分子量50 KDa)，采用13000 rpm離心30 min，測定游離藥物濃度(C游離)，另精密量取TP-EL 1 mL置5 mL量瓶中，加甲醇適量超聲后，繼續加甲醇稀釋至刻度，測定總藥量(C)，按如下公式計算，即得。包封率(%)=(C-C游離)/C×100%。

2.4.6 TP-EL中藥物含量測定 采用文獻報道的方法測定TP-EL中TP的含量[15]。精密稱取TP-EL 1.0 mL(W，約含TP 5 mg)置 5 mL量瓶中，加甲醇適量超聲后，繼續加甲醇稀釋至刻度。精密吸取上述溶液1 mL置25 mL 量瓶中，加蒸餾水4 mL，酒石酸亞鐵溶液5 mL充分混合，再加入pH=7.5的磷酸緩沖液稀釋至刻度，于533 nm處測定吸收度A1，另取TP對照品約25 mg置25 mL容量瓶中，加甲醇適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻后精密量取1 mL置25 mL容量瓶中，按相同方法操作后測定吸收度A2，以外標法計算藥物的含量。

2.4.7 TP-EL的初步穩定性 取TP-EL置于西林瓶中，密封，在6±2℃條件下避光放置，分別于0、15 d、30 d取樣，考察外觀、pH值、含量及包封率的變化。

3 結果

3.1 單因素考察

3.1.1 磷脂的濃度 脂質體制劑中磷脂的濃度一般1%～5%。磷脂濃度大，脂質體粒徑較大，較易發生脂質體間的絮凝、融合，導致制劑的物理穩定性較差，但載藥量大，包封率高；磷脂濃度低，脂質體粒徑小且均勻，制劑較穩定，但載藥量小。磷脂濃度對TP-EL包封率的影響見圖1a，結果表明，磷脂濃度2%～5%，隨著磷脂濃度的增大，脂質體包封率逐漸增大。當磷脂濃度為4%和5%時，脂質體的包封率變化不大。

3.1.2 磷脂與膽固醇的比例 磷脂與膽固醇的比例對TP-EL包封率的影響見圖1b。由圖可知，在所考察的比例范圍內，隨著磷脂與膽固醇比例增加，TP-EL的包封率逐漸降低。當磷脂與膽固醇的比例為3∶1和5∶1時，TP-EL的包封率較高分別為70.39±0.69%和69.44±0.36%。

3.1.3 藥物與磷脂的比例 脂質體的包封率和穩定性與藥脂比密切相關，投藥量過多，超出磷脂的承載能力，則無法形成穩定的脂質體。而藥脂比過小時，載藥量過低，需要給予較大體積的脂質體才能達到治療目的，不利于實際應用。因此本文對藥物與磷脂的比例進行考察，結果見圖1c。結果表明，當藥脂比從1∶2增加至1∶8時，TP-EL的包封率由33.09±0.35%增加至69.70±1.04%，當藥脂比繼續增加至1∶10時，TP-EL的包封率略有增加。

3.1.4 制備溫度 本研究考察制備溫度對TP-EL包封率的影響，結果見圖2a。由圖可知，在所考察的溫度范圍內，溫度對TP-EL的包封率影響不大。因溫度較高會加速磷脂的氧化，故選擇30℃制備TP-EL。

3.1.5 攪拌時間 以包封率為評價指標考察了攪拌時間對制備TP-EL的影響。本研究分別測定了攪拌時間為5 min、20 min、40 min及60 min時脂質體的包封率，結果見圖2b，當攪拌時間由5 min增加至40 min時，包封率由45.68±4.07%增加至67.91±0.53%，當攪拌時間增加至60 min時，脂質體的包封率下降至64.96±1.03%。

3.2 正交設計 正交試驗結果見表2。由表2可知，各因素對脂質體包封率的影響程度為a>b>c，方差分析結果見表3，直觀分析與方差分析結果一致，即a因素對TP-EL的包封率有顯著的影響(P<0.05)。故確定因素最佳處方條件組合為a3b1c3，即磷脂濃度為4%、磷脂與膽固醇的質量比為5∶1、藥脂比為1∶8。

表3 方差分析結果

3.3 TP-EL質量評價

3.3.1 TP-EL的外觀 脂質體外觀是評價其質量的一個直觀標準，肉眼觀察TP-EL為半透明乳狀液，且帶明顯的乳光(圖3a)。

3.3.2 形態觀察 采用透射電鏡磷鎢酸負染法觀察所制備的TP-EL的形態結構。結果見圖3b，結果表明，所制備的TP-EL大多為單室脂質體。

3.3.3 TP-EL的粒徑及Zeta電位 采用乙醇注入法制備的TP-EL粒徑分布均勻(圖4)，平均粒徑為123.0±13.2 nm，PDI為0.15±0.07。TP-EL的Zeta電位為-35.2 mV，TP-EL所帶相同電荷之間的排斥作用能夠有效的阻止脂質體的相互聚集，提高TP-EL的聚集穩定性。

圖1 a:不同磷脂濃度對TP-EL包封率的影響；b:不同磷脂與膽固醇的比例對TP-EL包封率的影響；c:不同藥物與磷脂的比例對TP-EL包封率的影響

圖2 a:不同溫度對TP-EL包封率的影響;b:不同攪拌時間對TP-EL包封率的影響 圖3 a:TP-EL的外觀；b:TP-EL的形態

圖4 TP-EL的粒徑分布

3.3.4 pH值 磷脂易氧化水解，其氧化水解速率受環境pH值的影響較大，只有在一定的pH范圍內才比較穩定。文獻報道[16]，卵磷脂、大豆磷脂、磷脂酰基甘油酯等脂質成分在pH 6.5時最穩定，水解速率常數最小。本文測得TP-EL的pH值為6.25±0.14，利于脂質體和藥物的穩定性。

3.3.5 TP-EL的包封率 采用乙醇注入法制備三批TP-EL，并采用超濾離心法測定包封率，測得脂質體的平均包封率為71.82±2.03%。

3.3.6 TP-EL中藥物含量測定 采用紫外分光光度法對所制備的三批TP-EL中TP的含量進行測定。測得TP含量的平均值為5.19±0.17 mg/mL。

3.3.7 TP-EL的初步穩定性 TP-EL的初步穩定性試驗結果見表4。結果表明，TP-EL在6±2℃條件下避光放置1個月后，與0時樣品相比，脂質體未見分層，pH值及TP的含量無明顯變化，但包封率略有下降，說明TP-EL長期放置物理穩定性良好。

表4 TP-EL初步穩定性

4 討論

4.1 本研究制備的TP-EL作為一種新型經皮給藥載體，具有生物相容性好、性質穩定、包封率較高、制備工藝簡單的特點。采用乙醇和丙二醇組成的混合醇制備的TP-EL一方面能夠通過增加醇脂質體的黏度及負電荷來提高TP-EL的穩定性，另一方面降低了乙醇在處方中所占的比例，抑制乙醇揮發且減弱了它對皮膚的刺激性。與乳膏劑及普通脂質體相比，TP-EL又能夠利用醇脂質體自身的柔韌性順利通過皮膚微孔，從而提高藥物的經皮滲透性及皮膚滯留量。

4.2 膽固醇能夠適當提高藥物的包封率和穩定性 膽固醇的作用是調節脂質雙分子層的流動性，被稱為脂質體“流動性緩沖劑”。對于水溶性藥物，適當提高膽固醇的比例，可以增加脂質體中內水相的體積，提高藥物的包封率。通常在一定范圍內磷脂與膽固醇的比例越小，脂質體包封率越高、穩定性越好。本研究制備的TP-EL包封率隨著磷脂與膽固醇比例的增加而減少。當磷脂與膽固醇比例為5∶1時，形成的脂質體包封率較高為(69.44±0.36)%。

4.3 TP-EL初步穩定性考察 結果發現在6±2℃條件下避光放置1個月后，脂質體未見分層，pH值及藥物含量無明顯變化，但包封率有所下降。包封率下降可能是由于天然磷脂中含有不飽和脂肪酸鏈，易氧化和水解，使脂質體膜的性質發生改變，導致包封率下降。因此，可在制備TP-EL的過程中加入抗氧劑或將TP-EL制成凍干產品，以保證其長期穩定。