優化人臍血間充質干細胞方法的建立

孫海梅 楊 姝 吳 波 孫婷怡 周德山 季鳳清

(首都醫科大學人體解剖與組織胚胎學系，北京 100069)

人臍帶血(human umbilical cord blood， HUCB)是胎兒出生時臍帶內及胎盤近胎兒一側血管內的血液，已有研究[1]證明人臍血中含有豐富的造血干細胞及間充質干細胞(mesenchymal stem cells， MSCs)。人臍血間充質干細胞(cord blood-mesenchymal stem cells，CB-MSCs)其形態和生物學特點與骨髓MSCs極為相似，同樣具有自我更新和多向分化的潛能，在一定的實驗條件下可以分化為骨、脂肪、肌肉，甚至可以跨胚層分化為神經樣細胞[2-3]，這就為細胞移植提供了一種新的種子細胞來源。

然而，目前在CB-MSCs過程中，往往出現純度不高，且常有大量的混雜細胞，因此，建立優化的CB-MSCs分離純化方法，將有助于獲得更高純度和豐度的CB-MSCs。人羊膜組織是胚胎發育的早期產物，由于人羊膜具有無毒、無菌、無刺激性、抗微生物、分泌多種細胞生長因子、不表達人類白細胞ABC抗原(human leukocyte antigen-ABC，HLA-ABC)和人類白細胞DR抗原(human leukocyte antigen-DR，HLA-DR)抗原、易于獲得和處理等特性[4]，近十幾年來廣泛應用于組織工程和臨床移植治療，尤其在眼科應用更多，但是利用羊膜上皮細胞分離純化CB-MSCs的研究方法仍鮮有報道。

本研究利用插入式培養皿共培養人羊膜上皮細胞和分離出的人臍血單個核細胞，觀察培養細胞的生長狀況；通過免疫熒光染色觀察 CB-MSCs表達干細胞特異性抗原神經巢蛋白Nestin和反映細胞增生的核抗原Ki67的情況；應用流式細胞技術檢測CB-MSCs表面標志物CD166的表達。探討利用羊膜上皮細胞共培養法優化CB-MSCs的培養條件，提高CB-MSCs的純度的可行性，為純化CB-MSCs提供一種新方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本材料

臍帶血取自首都醫科大學宣武醫院產科健康育齡產婦足月正常產或剖宮產產婦，同時采集分娩的羊膜組織，獲得所有患者的知情同意(倫理號：2013-X-036)。

1.1.2 試劑材料

HG-DMEM培養基和胰蛋白酶(trypsin)(美國Gibco公司)；肝素(Heparin，粉劑，140 U/mg，北京雙螺旋生物培養基制品廠)；羊血清、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)(美國Hyclone公司)；甲基纖維素(美國Sigma公司)；人淋巴細胞分離液(d=1.077 g/mL，天津TBD公司)；兔抗神經巢蛋白(Nestin)和增生細胞相關抗原Ki67多克隆抗體(美國Abcam公司)；小鼠抗人CD166-PE(美國BD PharMingen公司)；FITC標記山羊抗兔IgG(美國Chemicon公司)；Hoechst33342(美國Sigma公司)，6孔插入式培養皿(美國Millicell公司)；熒光顯微鏡(日本Nikon公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 羊膜上皮細胞的分離及培養

從健康產婦分娩的胎盤組織胎兒面小心剝離羊膜全層，剪取0.5 cm×0.5 cm組織塊行常規石蠟包埋和HE染色。其余羊膜組織置入預冷的PBS中徹底清洗干凈后，自羊膜與絨毛膜間的潛在空隙鈍性分離出羊膜上皮層，浸于PBS中清洗2次，用眼科剪剪成糜狀，移至含0.2%(質量分數)胰蛋白酶的HG-DMEM培養液中，置于37 ℃水浴搖床消化30 min，用等體積的HG-DMEM完全培養基[含10%(質量分數)FBS、105 U/L青霉素和105 U/L鏈霉素]終止消化，150目篩網過濾2次，收集細胞，PBS重懸，離心洗滌2次，棄上清，用HG-DMEM完全培養基重懸細胞，臺盼藍計數細胞后，以5×105/mL的密度接種于插入式培養皿中，置于37 ℃、5%(體積分數) CO2的培養箱中培養。2～3 d細胞完全貼壁后全量換液。

1.2.2 臍血單個核細胞的分離及培養

無菌條件下采集健康新生兒的臍血40～60 mL，20 U/mL肝素抗凝，無菌PBS等體積稀釋，按 1∶4比例加入0.5%(質量分數)甲基纖維素PBS溶液，混勻，靜置40～60 min后，紅細胞沉于底部，吸取血漿層離心，棄上清，PBS重懸，制備成單細胞懸液，輕柔疊加至裝有等體積人淋巴細胞分離液的離心管中，離心20 min(1 800 r/min，慢起慢降)，離心后用吸管小心吸取中間的白膜細胞層至另一離心管中，PBS離心洗滌3次，再用HG-DMEM完全培養基重懸細胞，以3×106/mL的密度接種在6孔板中(孔中預置蓋玻片)，置于37 ℃、5%(體積分數) CO2的培養箱中培養。根據細胞生長情況，每2～3 d半量換液1次，待細胞完全貼壁后全量換液。

1.2.3 臍血單個核細胞與羊膜上皮細胞共培養

臍血單個核細胞于6孔板中生長3 d完全貼壁，全量換液后分2組進行培養：(1)常規培養組：加入4 mL HG-DMEM完全培養基培養；(2)羊膜共培養組：將培養羊膜上皮細胞(60%～70%融合度)的插入式培養皿放入培養臍血單個核細胞的6孔板內，內外各加入2 mL HG-DMEM完全培養基。倒置顯微鏡下觀察CB-MSCs生長情況和形態變化。

1.2.4 免疫熒光染色檢測CB-MSCs表面標志物Nestin和增生細胞相關抗原Ki67

培養5 d后，取出生長有CB-MSCs的蓋玻片，4%(質量分數)多聚甲醛溶液固定，PBS洗3次，3%(體積分數) H2O2-甲醇溶液室溫孵育30 min，阻斷內源性過氧化物酶，PBS洗3次，羊血清封閉，室溫孵育30 min，棄去羊血清，分別滴加兔抗Nestin抗體(濃度1∶200)、兔抗Ki67抗體(濃度1∶100)，4 ℃過夜，PBS洗3遍，滴加FITC標記的山羊抗兔熒光二抗(濃度1∶200)，37 ℃避光孵育30 min，PBS洗3遍，滴加Hoechst 33342(0.05 g/L)復染細胞核，室溫避光孵育3 min，熒光封片劑封片后在熒光顯微鏡下觀察染色結果。

1.2.5 流式細胞儀檢測CB-MSCs表面標志物CD166

培養5 d后，胰酶消化CB-MSCs，PBS洗3次，取細胞濃度為1×106/mL的細胞懸液100 μL，加入20 μL小鼠抗CD166抗體標記細胞，室溫避光孵育30 min，離心棄去染液，PBS洗2次，制備成500 μL單細胞懸液，上機檢測。陰性對照組采用同型對照抗體。

2 結果

2.1 人羊膜組織 HE染色及培養羊膜上皮細胞的形態學觀察

對人羊膜組織石蠟切片進行HE染色可見人羊膜分為5層：上皮細胞層、基底膜層、致密層、纖維細胞層及海綿層(圖1A)；羊膜上皮細胞層由無纖毛的立方上皮細胞或低柱狀細胞組成(圖1B)。分離培養的羊膜上皮細胞2 d后可貼壁生長，3～5d可達到60%～70%融合狀態(圖2A)；羊膜上皮細胞呈多角形或不規則形，邊界清晰，形態大小基本一致，胞核較大，呈圓形，位于細胞中央(圖2B)。

圖1 人羊膜組織HE染色Fig.1 HE staining shows human amniotic tissue

A： five layers of amniotic tissue;1： amnion endothelial cell layer;2： basal membrane layer;3： compact layer;4： fibrocyte layer;5： spongy layer；B： amniotic epithelial cells.

圖2 培養人羊膜上皮細胞Fig.2 Cultured human amniotic epithelial cells

2.2 不同培養條件下CB-MSCs的形態學觀察和比較

剛接種時的臍血單個核細胞呈懸浮狀態，24 h后細胞開始逐漸貼壁；接種3 d左右大量細胞貼壁，細胞聚集生長，形成較多的島狀或巢樣的細胞團(圖3)。此時將臍血單個核細胞分成常規培養組和與人羊膜上皮細胞共培養組，繼續培養5 d后可見兩組細胞均增大，形態飽滿，由圓形向卵圓形、紡錘形、梭形變化，大量細胞伸出較長突起，逐漸出現典型的MSCs樣形態特點(圖4)。共培養組(圖4A)較常規培養組(圖4B)的CB-MSCs細胞密度更大，帶有突起，呈紡錘形或梭形的細胞數量更多，細胞狀態更佳。

圖3 人臍血單個核細胞培養3 d時的巢樣細胞團Fig.3 Typical nest of cultured mononuclear cells fromumbilical cord blood on day 3

圖4 不同培養條件下的CB-MSCsFig.4 CB-MSCs cultured under different conditions

2.3 Nestin和Ki67免疫熒光染色

兩組細胞均可見陽性細胞：Nestin表達在細胞質內(圖5綠色)，而Ki67表達在細胞核內(圖5綠色)，與復染藍色熒光的細胞核疊加而呈淡藍色(圖6)。經比較發現：共培養組(圖5A)Nestin陽性的CB-MSCs數量和比例均明顯高于常規培養組(圖5B)；此外，共培養組(圖6A)Ki67陽性的CB-MSCs數量亦明顯多于常規培養組(圖6B)。

圖5 免疫熒光顯示Nestin在CB-MSCs的表達Fig.5 Immunofluorescence staining shows Nestin expression in CB-MSCsA： co-cultured with human amniotic epithelial cells； B： regular cultured；CB-MSCs：cord blood-mesenchymal stem cells.

圖6 免疫熒光顯示Ki67在CB-MSCs的表達Fig.6 Immunofluorescence staining shows Ki67 expression in CB-MSCsA： co-cultured with human amniotic epithelial cells； B： regular cultured；CB-MSCs：cord blood-mesenchymal stem cells.

2.4 流式細胞術檢測CB-MSCs表面標志物CD166的表達

共培養組CB-MSCs中表達CD166的陽性細胞率約為79.8%(圖7)，顯著高于常規培養組，其CD166的陽性細胞率約為50.2%(圖8)。

圖7 流式細胞術檢測CD166在共培養組CB-MSCs的表達Fig.7 Flow cytometry shows CD166 expression in CB-MSCs co-cultured with human amniotic epithelial cells

A： isotype antibody control；B： co-cultured with human amniotic epithelial cells;CB-MSCs: cord blood-mesenchymal stem cells.

圖8 流式細胞術檢測CD166在常規培養組CB-MSCs的表達Fig.8 Flow cytometry shows CD166 expression in CB-MSCs regularly culturedA： isotype antibody control； B： regular cultured; CB-MSCs: cord blood-mesenchymal stem cells.

3 討論

有文獻[5-6]報道，為了獲取更多高純度的MSCs，采用了多種方法：如單純使用某種細胞生長因子或加入富含多種生長因子的細胞上清液，以促進其增生和定向誘導分化。目前已證實羊膜上皮細胞可分泌多種細胞生長因子，這些生長因子能夠促進MSCs的生長和誘導分化[7-8]。本實驗應用插入式培養皿將羊膜上皮細胞與人臍血單個核細胞共培養，結果表明，與常規培養方法相比，共培養法可獲得更多的CB-MSCs，且CB-MSCs的增生能力更強。從方法上看，共培養法具有以下優勢：(1) 人羊膜組織來源豐富，易于取材，免疫原性低，羊膜上皮細胞與臍血干細胞的來源同屬一人，更具有組織相容性，不會引起免疫排斥反應，不涉及倫理道德等優點； (2)共培養法不僅克服了單純使用營養因子的用量和比例不易掌握的問題，也比使用羊膜上皮細胞上清液處理CB-MSCs更新鮮、更動態和更持續；(3) 生長狀態下的羊膜上皮細胞可持續分泌多種促進CB-MSCs生長、增生和定向分化的營養因子，如多效生長因子PTN，更有利于模擬CB-MSCs細胞生長的微環境。綜上，利用插入式培養皿將人羊膜上皮細胞與人CB-MSCs共培養，可以較大地提高CB-MSCs的純度和數量，為純化CB-MSCs提供一種新途徑。