周細胞在慢性腦血流低灌注血-腦脊液屏障損傷中的作用

曹丹丹 孫 靜 白云飛 王 苗 郭晨佳 崔 靜 李 良

(首都醫科大學基礎醫學院病理系，北京 100069)

慢性腦血流低灌注(chronic cerebral hypoperfusion, CCH)是阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD) 和血管性癡呆的重要發病危險因素，動脈硬化、心輸出量減少、血壓過高或過低等都是造成CCH的原因。CCH使腦組織能量代謝障礙，引起神經遞質紊亂、氧化應激、神經炎性反應，導致神經元損傷和白質病變，從而引起認知功能障礙[1]。血-腦脊液屏障(blood brain barrier, BBB)是腦組織與血液之間的物質交換屏障結構，具有調節血液中營養物質、代謝產物、各種電解質出入腦組織，維持神經系統正常內環境的作用。BBB損傷可引起有毒物質聚集、炎性細胞因子和免疫細胞遷移至腦實質，引起腦組織炎性反應等一系列損傷。周細胞是BBB的重要組成成分之一，對于血管形成、控制腦血流量、維持BBB功能等都發揮著重要作用[2]。近些年來，周細胞在神經系統疾病中的作用逐漸引起人們的重視，而其在CCH時的變化尚未見報道。大鼠雙側頸總動脈結扎(two-vessel occlusion, 2-VO)模型是目前國內外公認的能夠模擬人類CCH的動物模型[3-4]。本研究擬采用2-VO大鼠模型，探討周細胞在腦低灌注BBB損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

小鼠CD31抗體 (谷歌生物公司); 小鼠PDGFRβ抗體 (美國Abcam公司)；FITC標記兔抗人纖維蛋白(原)抗體 (北京中杉金橋公司)；小鼠四型膠原抗體、人纖維蛋白原、CCK-8細胞活性試劑盒購于美國Sigma公司；Alexa Fluor 488/594 山羊抗小鼠IgG購于美國Invitrogen公司。

石蠟包埋機、輪轉式切片機(德國Leica公司)；熒光顯微鏡(德國Leica 公司);小動物磁共振成像設備(德國Bruker 公司)；透射電子顯微鏡(日本日立公司HT7700)。

1.2 動物與分組

12周齡雄性Wistar大鼠，SPF級，購自北京維通利華動物供應中心，實驗動物合格證號：SCXK京2002-0003。將大鼠采用數字表法隨機分為4組: 對照組、3 d模型組、14 d模型組和30 d模型組，每組動物12只。

1.3 2-VO動物模型的制備

10%(質量分數)水合氯醛3×10-3mL/g腹腔注射麻醉，仰臥位固定，常規消毒，行頸正中切口，分離雙側頸總動脈，模型組用絲線行雙側頸總動脈結扎[4]；對照組只做雙側頸總動脈分離不結扎，縫合切口。

1.4 腦血流量檢測

應用7.0T磁共振動脈自旋標記( arterial spin labeling, ASL) 技術測定大鼠腦血流量(cerebral blood flow, CBF)[5]。使用 Pharma Scan 7.0/ 16US 磁共振成像系統，對所有大鼠行常規ASL序列掃描，選取感興趣區，測量雙側頂葉深部皮質CBF值。

1.5 免疫組織熒光染色

大鼠灌注固定后行連續冠狀位切片，厚25μm，根據Paxinos和Watson大鼠腦圖譜選取相同部位的冠狀切面進行染色，一抗4 ℃過夜；二抗室溫避光孵育，封片后在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.6 大鼠腦周細胞原代培養

依照文獻[6]報道的方法分離腦微血管段，用含10%(質量分數)FBS的高糖DMEM培養基37 ℃、5%(體積分數) CO2培養箱培養，至第10天后，胰酶消化、傳代。體外實驗采用3～10代周細胞。

1.7 CCK-8檢測細胞增生活力

原代培養周細胞每孔5 000個接種于96孔細胞培養板，24 h后分別加入不同濃度纖維蛋白原，培養24 h后每孔加CCK8試劑10 μL，溫育2 h后450 nm處測定吸光度(A) 值。實驗重復進行3次。

1.8 電鏡檢測

動物處死后快速取下頂葉深部皮質，經固定、脫水、包埋、固化后，超薄切片機切片、飽和醋酸鈾、0.5%(質量分數)檸檬酸鉛染色，透射電鏡觀察，拍片。

1.9 統計學方法

2 結果

2.1 2-VO大鼠不同時期腦血流改變

ASL結果顯示，與對照組相比，2-VO術后 3 d時頂葉皮質血流量為對照組的35%，2-VO術后 14 d時血流量為對照組的57%，2-VO 術后 30d時血流量為對照組的80%(圖1)，2-VO模型大鼠大腦皮質處于持續血流低灌注狀態。

2.2 BBB改變

纖維蛋白原免疫熒光染色結果顯示，2-VO術后3、14和30 d時血管周圍均有纖維蛋白原滲漏，并且隨著時間延長纖維蛋白原血管外沉積逐漸增多(圖2A)；電鏡下觀察，與對照組相比，腦慢性缺血后可出現血管基膜增厚、星形膠質細胞足突腫脹、血管外周圍間隙致密物質沉積以及紅細胞滲漏等(圖2B)。2-VO模型不同時期均出現BBB損傷。

2.3 慢性腦血流低灌注對周細胞的影響

血管周細胞免疫熒光染色結果顯示，與對照組相比，2-VO術后 3 d周細胞數量開始增多，為對照組的1.5倍，14 d時周細胞數量增加到對照組的2倍，至術后30 d時有所下降，為對照組的1.4倍(圖3A、C)；血管內皮免疫熒光染色結果顯示，模型組各個時期深部腦皮質血管數量與對照組相比無明顯變化(圖3B、D)；采用不同濃度纖維蛋白原處理原代培養周細胞，CCK-8檢測細胞的增生情況，與對照組相比，0.25 g/L纖維蛋白原對周細胞無增生或毒性作用，而0.5、1、1.5、2.5、5和10 g/L纖維蛋白原對周細胞均有促增生作用，在1 g/L 細胞活力最高，達到120%；20 g/L時周細胞出現明顯死亡，細胞活力為對照組的75%(圖3E)。

圖1 腦血流改變Fig.1 Changes of CBF by ASL

*P<0.05vscontrol,***P<0.001vscontrol,n= 6；CBF: cerebral blood flow;ASL: arterial spin labeling；2-VO:two-vessel occlusion.

圖2 大鼠大腦皮質血-腦脊液屏障改變Fig.2 BBB changes in different stages of 2-VO rat model

A: fibrinogen leakage in the cortex, COL4α for type IV collagen (red), fibrinogen (green); bar=75μm;B: electron microscopic image of BBB in the cortex;a: astrocytic foot;b: red blood cell leakage;c: vascular lumen;p: pericyte;Thinarrow: vascular basement membrane;Thickarrow: the dense deposit in the extravascular space; Bar=1μm (n=3);BBB：blood brain barrier；2-VO:two-vessel occlusion.

3 討論

大鼠2-VO模型被廣泛用于CCH損傷的研究，該模型中血管閉塞穩定且持久，腦灌注不足是全腦性的，不出現局灶性腦梗死。急性期CBF急劇下降至正常水平的35%～45%，由于Willis環的代償作用，1周后開始逐漸恢復進入慢性期，至3個月時CBF仍維持在正常的80%左右，此期與老齡化及AD患者的腦血流變化最相似[3]。本實驗結果為2-VO術后 3 d時頂葉皮質CBF為對照組的35%，2-VO術后14 d時CBF為對照組的57%，2-VO 術后 30 d時血流量為對照組的80%，此結果與文獻[3]報道相一致。

圖3 大鼠大腦皮質周細胞數量變化以及纖維蛋白原對周細胞增生的影響Fig.3 Number of pericytes in cortex and the effect of fibrinogen on pericytes proliferation

A: PDGFRβ+pericyte, bar=50 μm;B: CD31+endothelial cells, bar=100 μm;C: number of pericyte;D: vascular number;E: pericyte activity assay；*P<0.05,**P<0.01vscontrol,##P<0.05vs2-VO 14 d (n= 3);2-VO:two-vessel occlusion.

BBB主要由血管內皮細胞、周細胞、基底膜和星形膠質細胞足突組成[7]。其中內皮細胞及其之間的緊密連接形成物理屏障；星形膠質細胞分泌細胞外基質蛋白維持基底膜的功能，并完成血管和神經元之間的信號傳遞。正常情況下，血液中的大分子物質如纖維蛋白原、纖維蛋白等不能通過BBB進入腦實質，而在缺血條件下，氧化應激增加[8]、炎性細胞浸潤[9]等參與破壞微血管完整性，導致通透性增高，血漿蛋白滲漏。本實驗中觀察到2-VO模型組有纖維蛋白原的血管外滲漏，并且在電鏡下觀察到BBB超微結構的改變，說明在CCH損傷過程中大腦皮質存在BBB的損傷。

周細胞為BBB的重要組成部分，其主要功能除了維持BBB穩定之外，還包括調節CBF及血氧代謝、調節血管穩定性、神經干細胞功能和吞噬細胞活性等[10-12]。本研究中觀察到，2-VO 術后3 d周細胞數量開始增多，至14 d時周細胞數量最多，后期隨著缺氧時間的延長，周細胞數量呈現下降趨勢。然而血管數量并沒有明顯變化，因此周細胞增生并非由血管增多所引起。在慢性缺血早期，腦血流的減少還可能與周細胞的收縮有關[13]，因此在CCH早期周細胞的增多可能進一步加劇CBF減少，加速BBB損傷。有研究[14]顯示，纖維蛋白原的滲出可刺激少突膠質細胞的變化，那么滲出的纖維蛋白是否對周細胞的增生有影響？因此本研究通過體外培養周細胞，檢測不同濃度纖維蛋白原對周細胞的增生或毒性作用。結果表明低濃度纖維蛋白原對周細胞具有一定的促增生作用，而高濃度纖維蛋白原對周細胞具有毒性作用。因此CCH模型中早期觀察到的周細胞數量增多可能與早期少量纖維蛋白原的滲漏有關，慢性期時周細胞數量的減少，可能與腦組織中纖維蛋白原累積增多，對周細胞產生毒性作用有關。有研究[15]表明，周細胞可以分泌基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)2和9(MMP-2、MMP-9)，而MMP-2、MMP-9被蛋白水解酶激活后可作用于基底膜，破壞BBB[16-18]，因此周細胞的增生可能進一步加劇了BBB的損傷。當然這一假設需要后續實驗的進一步驗證。

總之，本研究發現，CCH可破壞BBB，早期伴有周細胞增生。BBB損傷導致的纖維蛋白原滲出可能是引起周細胞增生的主要原因，同時周細胞增生也可能進一步加重腦缺血及BBB損傷。