胰蛋白酶法提取魚腥草多糖工藝的優化

杜晶 汪珊

摘要 目的：正交試驗篩選胰蛋白酶提取魚腥草多糖的最佳工藝。方法：對胰蛋白酶添加量、溫度、時間等因素采用L9（34）正交試驗法，尋求最佳提取工藝。結果：最佳提取工藝為溫度45℃，pH=7，酶加入比例2%），提取時間2.5h。結論：正交試驗法可用于魚腥草多糖胰蛋白酶提取工藝的優選。

關鍵詞 魚腥草多糖；胰蛋白酶；正交試驗；最佳工藝

鮮魚腥草屬于蕺菜，以多糖得率、多糖含量為指標[1-4]，我們利用正交試驗法對胰蛋白酶提取魚腥草多糖的最佳工藝進行尋找，報告如下。

資料與方法

儀器和試劑：干品魚腥草購于廣州清平市場，經廣東藥學院中藥鑒定教研室姬生國博士鑒定為三白草科蕺菜屬植物Houttuvnia cordata Thunb的全草；胰蛋白酶（250 N.F.U/mg）；葡萄糖標準品；苯酚、濃硫酸、氨水、95%乙醇均為分析純；苯酚試液（自配）[5]。UV1800紫外一可見分光光度汁；電熱恒溫水浴鍋。SHB3循環水真空泵，GZX-9240MBE數顯鼓風干燥箱，AY120電子天平。

方法：魚腥草多糖含量測定方法的建立。①對照品溶液的制備：精稱已恒重的葡糖糖對照品0.0982g，加水溶解并定容至100 mL，再取1 mL，定容至10 mL容量瓶中，得濃度0.0982mg/mL對照品溶液。②供試液溶液的制備：稱取魚腥草5.0g，按正交設計表提取，得粗多糖。精稱已恒重的粗多糖0.1000g，加水定容至50mL，再移取1mL，定容至10mL，搖勻即得。③標準曲線制作：精密移取對照品0.0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，置10 mL容量瓶水定容，于489 nm對吸收度A進行測定，以吸收度A對含量C進行回歸，得回歸方程：Y=8.428 6X-0.025 8，γ（相關系數）=0.995 9。結果表明良好的線性關系出現在葡萄糖0.0196-0.0588mg/mL的范圍內。④重現性試驗：對50℃干燥至恒重的魚腥草粗多糖6份進行精密稱取，分別置于100mL的容量瓶中復溶，再取2mL定容至10mL，按標準曲線項下的方法操作，測定吸光度，RSD=0.3%，表明用苯酚一硫酸法進行魚腥草多糖的含量分析，重現性好，實驗結果可靠。⑤樣品多糖含量測定方法：取供試品溶液1mL，置于試管中，加1mL苯酚，5mL濃硫酸，振搖均勻，顯色>40min。置UV1800型分光光度計中，于489nm測定吸收度。根據回歸方程計算多糖含量。⑥樣品多糖提取的得率：稱取魚腥草藥材5.0g，按照正交設計表進行提取，得粗多糖。多糖得率=100%×（粗多糖的量/藥材的量）。魚腥草多糖的提取方法：精稱魚腥草藥材5.0g，提取時按正交設汁表進行，提取液濃縮至原料重：溶液體積1：4，80%乙醇醇沉，靜置>2h，抽濾，將濾餅取出，50℃烘箱烘干，得粗多糖。正交試驗法優化胰蛋白酶提取魚腥草多糖工藝：制定因素水平表，在單因素試驗的基礎上pH=7，以酶添加量、溫度、時間為考察因素采用L9（34）正交試驗法，衡量提取效率的客觀指標選取多糖得率及含量，優選最佳提取工藝。

采用加權評分法對數據進行分析，把多糖得率、多糖含量與該列最大數值相比，再×100，即得該項得分。根據多糖得率（x）和多糖含量（y）的作用，確定兩者的權重系數分別為0.4、0.6，加權求和兩項指標得分，通過公式得到綜合評分w=0.4x+0.6y。

結果

由表1得胰蛋白酶提取多糖的影響因素大小順序：A>B>C，其中A、B因素各水平之間差異有統計學意義。最佳提取條件為AIBIC2，即pH=7.0加入胰蛋白酶2%，溫度45℃，浸提時間2.5 h。胰蛋白酶酶法提取魚腥草多糖L9（34）正交試驗方案及結果，見表1。

討論

本試驗對胰蛋白酶提取魚腥草多糖的工藝進行正交試驗，用測量多糖的率和多糖含量為指標，綜合各因素的影響，得最佳提取工藝：胰蛋白酶2%，40倍體積的pH=7，45℃溫度下浸提2.5 h。該工藝既保證了得率，又提高了多糖含量，為魚腥草多糖進一步研究提供了理論依據。

參考文獻

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