γ-干擾素體外釋放試驗對活動性肺結核的診斷價值

閔少菊，劉　念，譚玉潔

近年來，隨著人口大規模流動及多重耐藥結核菌菌株的出現，肺結核疫情呈上升趨勢［1－3］。 傳統檢測方法如PPD試驗，受卡介苗接種影響導致檢測結果假陽性率偏高，痰涂片陽性檢出率較低，難以滿足臨床診療的需要，如何快速、準確診斷肺結核已成為臨床醫師和檢驗醫師重點關注和亟待解決的問題。以T細胞免疫為基礎的TB－IGRA試驗在結核分枝桿菌感染檢測中應用較廣［4，5］。 TB－IGRA 是利用在大部分的非結核分枝桿菌以及所有的牛型分枝桿菌（包括卡介苗）中均不存在，而在結核分枝桿菌中存在的菌種特異性抗原，體外刺激活化T淋巴細胞產生 IFN－γ的原理而建立［6］。因此，TBIGRA特異性比PPD高得多，使其在臨床得到廣泛應用［7］。該研究通過TB－IGRA試驗測定活動性肺結核組、非活動性肺結核的呼吸疾病組和健康對照組特異性IFN－γ水平，繪制ROC曲線，探討TBIGRA對活動性肺結核的診斷和鑒別診斷價值，并與結核桿菌抗體和痰涂片抗酸染色方法進行比較，分析TB－IGRA對活動性肺結核的臨床診斷價值。

1　資料與方法

1.1標本來源選取筆者所在醫院2016年1—12月進行TB－IGRA試驗住院患者280例。分為活動性肺結核組120例，其中男72例，女48例；平均年齡（44．30±19．18）歲。 非活動性肺結核的呼吸疾病組160 例，男 95 例，女 65 例；平均年齡（58．24±17．49）歲。47名健康對照組為該院同期健康體檢者，男21名，女 26 名；平均年齡（50．51±10．16）歲。 活動性肺結核組根據我國2008年修訂的 《結核病的診斷標準和分類》確診分類，非活動性肺結核的呼吸疾病組標本來源于同期入院的結核菌涂片陰性的肺部疾病住院患者。健康對照組由本院體檢X線胸片無異常，無結核病臨床癥狀，同時排除心、肝、肺、腎等疾病的健康人群。

1.2儀器與試劑結核菌染色液（珠海貝索生物有限公司）、人結核桿菌IgG抗體檢測（膠體金法）試劑盒（北京貝爾）及結核感染T細胞檢測試劑盒（北京萬泰）。ST－360酶標儀和洗板機 （上海科華）、BSC1500ⅡB2－X生物安全柜（濟南鑫貝西）、電熱恒溫培養箱和電熱恒溫水浴箱等。

1.3試驗方法

1.3.1結核分枝桿菌γ－干擾素體外釋放試驗（TBIGRA）使用BD生產肝素抗凝的真空采血管采集全血至少4 ml；將標本輕柔顛倒混勻后分裝到陰性對照、測試及陽性對照培養管中，1 ml/管；顛倒混勻后立即放入37℃培養（22±2）h。將培養管3000轉/min離心10 min，取血清用ELISA法檢測IFN－γ含量。應用北京萬泰公司提供的自動計算軟件，輸入校準品濃度和校準品OD值繪制相應曲線，要求每次實驗所得曲線的相關系數R2＞0．99，在軟件中輸入樣本OD值后計算IFN－γ含量，并由軟件自動判定陰陽性結果。

1.3.2結核桿菌抗體（TB－Ab）實驗方法將待檢測標本 （檢測TB－IGRA后肝素抗凝管內全血3000轉/min離心10 min后分離出的血清）100μl加到檢測孔中，15～20 min內觀察結果。

1.3.3痰涂片抗酸染色法囑患者清晨用清水漱口后咳出肺深部的痰液，痰量不少于3 ml，置于專用有蓋痰盒內，專人及時送檢。在生物安全柜中制備痰涂片并于紫外燈下照射1 h待其自然干燥；5%苯酚復紅初染、3%酸性乙醇脫色和亞甲基藍溶液復染。先用低倍鏡觀察全片，再用高倍鏡鏡檢，至少觀察300個高倍鏡視野。

1.4統計學分析實驗數據用SPSS 19．0軟件處理，計量資料以x±s表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；計數資料采用百分率表示，組間比較采用χ2檢驗，以α＝0．05為顯著性檢驗水準。繪制ROC曲線，以Youden指數最大時的IFN－γ含量為最佳臨界值，并計算其靈敏度和特異性。

2　結果

2.1各組IFN-γ水平比較活動性肺結核組IFN－γ 水平［（156．86±128．19） pg/ml］，明顯高于健康對照組［（22．15±71．52） pg/ml］和非活動性肺結核的呼吸疾病組［（55．31±103．39） pg/ml］，差異均有統計學意義（t＝－8．593，t＝－7．115，均為 P＜0．05）；非活動性肺結核的呼吸疾病組IFN－γ水平高于健康對照組，以α＝0．05為顯著性檢驗水準，差異有統計學意義（t＝2．502，P＜0．05）。

2.2三種檢測方法結果陽性率比較TB－IGRA在活動性肺結核組陽性率顯著高于非活動性肺結核的呼吸疾病組和健康對照組，且差異均有統計學意義（P＜0．05）。在活動性肺結核組中，三種方法的陽性檢出率以 TB－IGRA最高，為 88．33%，且與結核抗體和痰涂片抗酸染色結果比較，差異有統計學意義（P<0.05）。 見表 1。

2.33種不同檢測方法對活動性肺結核的診斷效能評價TB-IGRA的靈敏度和陰性預測值分別為88.33%和90.79%，均高于其他兩種方法，而特異度及陽性預測值均低于其他兩種方法。見表2。

2.4繪制ROC曲線以活動性肺結核組為陽性組，健康對照組和非活動性肺結核的呼吸疾病組為陰性組繪制ROC曲線A；以活動性肺結核組為陽性組，健康對照組為陰性組曲線B。兩條曲線的靈敏度相同，但是曲線B的特異度明顯高于曲線A，這是因為剔除了非活動性肺結核的呼吸疾病組作為陰性對照結果后，大大提高了TB-IGRA檢測的特異度。見表3。

表 1　3種檢測方法陽性率分析

表 2　3種檢測方法的評價

表 3　不同ROC曲線的比較

3　討論

TB-IGRA是利用人體感染結核分枝桿菌后，體內致敏T淋巴細胞再次受到相同抗原刺激后，可迅速產生大量IFN-γ，檢測IFN-γ含量可間接反映體內結核分枝桿菌感染情況［8-10］。該方法與傳統結核桿菌感染診斷方法比較具有快速、簡便及利于批量檢測等優點，且選用的CFP10/ESAT6特異性蛋白可有效避免卡介苗接種后的假陽性結果。

該研究結果表明，活動性肺結核組IFN-γ水平均明顯高于非活動性肺結核的呼吸疾病組和健康對照組（P<0.05），說明人體感染結核分枝桿菌并發展為活動性肺結核后，血漿的IFN-γ水平明顯升高［11，12］，提示動態監測 IFN-γ 水平逐漸升高時，診斷為活動性肺結核的可能越大。TB-IGRA目前不能用于區分活動性肺結核、潛伏性結核感染和陳舊性結核［13］，而我國結核分枝桿菌感染率較高，故非活動性肺結核的呼吸疾病組和健康對照組IFN-γ水平升高，與被檢者可能存在陳舊性肺結核或與結核分枝桿菌潛伏感染有關，但高水平的IFN-γ含量可作為活動性肺結核重要的輔助診斷依據。

活動性肺結核組三種檢測方法陽性檢出率均顯著高于非活動性肺結核的呼吸疾病組患者和健康對照組（P<0.05），說明結核分枝桿菌在機體內處于活動期時，機體的免疫系統受到抗原刺激后無論是細胞免疫還是體液免疫均產生應答，因此三種方法對結核感染的診斷均有一定的參考價值［14］。但活動性肺結核組TB-IGRA的陽性率明顯高于結核桿菌抗體實驗和痰涂片抗酸染色法，且靈敏度最高，但其特異性均低于其他兩種方法，TB-IGRA、結核抗體和痰涂片抗酸染色法準確度分別為74.62%、69.72%、75.84%，表明TB-IGRA檢測具有較高的準確度。說明該方法對于活動性肺結核早期篩查具有一定臨床價值。由于我國人群結核分枝桿菌感染率偏高，潛伏感染可能性大，使得TB-IGRA檢測的特異度有所降低。統計顯示TB-IGRA對活動性肺結核組陽性預測值為60.57%，低于其他兩種方法；其陰性預測值最高為90.79%，提示TB-IGRA檢測的陰性結果對活動性肺結核的排除診斷具有重要作用［15］。

ROC曲線分析TB-IGRA應用于活動性肺結核特異性診斷的曲線下面積為0.898，有較高的輔助診斷價值，本研究結果顯示當IFN-γ臨界值被設定為19.11 pg/ml時，其對活動性肺結核病的輔助診斷具有較高的靈敏度（86.70%）和特異度（87.20%），可用于活動性肺結核組和健康人群的鑒別診斷。在以不同人群為陰性對照組繪制ROC曲線時，具有不同的特異度和診斷效能，主要是結核分枝桿菌潛伏感染的診斷缺乏“金標準”，而非活動性肺結核的呼吸疾病組中可能存在未診斷明確的肺結核患者，造成診斷特異度的差異。

TB-IGRA對活動性肺結核具有較高的臨床診斷價值，且血漿IFN-γ的含量較高時，對輔助診斷活動性肺結核的臨床意義較大。同時，其陰性結果對排除活動性肺結核也有重要價值。