枸杞葉發(fā)酵物生物活性成分及營養(yǎng)成分的變化研究

楊建平，郭建來，聶芙蓉，韓占兵，常選妞*

（1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，河南鄭州 450046；2.河南省飼料資源開發(fā)及安全評價(jià)工程技術(shù)研究中心，河南鄭州 450046）

枸杞（Lycium barbarum）屬茄科枸杞屬落葉灌木植物，適應(yīng)性強(qiáng)。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為枸杞具有“滋肝明目，清肺補(bǔ)腎”之功效，現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)證明枸杞具有抗氧化、抗腫瘤、延緩衰老、增強(qiáng)免疫能力、軟化血管、降低血脂等功效，因此枸杞產(chǎn)品日益受到消費(fèi)者的喜愛。現(xiàn)有研究表明，枸杞葉化學(xué)成分與枸杞子類似，主要有多糖類、多酚類、甜菜堿、維生素及多種微量元素，有些含量甚至比枸杞子還要高（陳雅林，2017），具有很高的營養(yǎng)保健功效。但目前枸杞葉并未引起足夠的重視，對其相關(guān)研究報(bào)道較少。因此開展對枸杞傳統(tǒng)非藥用部位的開發(fā)利用具有重要的理論及實(shí)踐意義。固態(tài)發(fā)酵技術(shù)可改變飼料原料的適口性，提高飼料原料的營養(yǎng)價(jià)值，能夠促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收和畜禽生長、抵御病原體侵襲、刺激機(jī)體免疫器官的成熟、調(diào)節(jié)物質(zhì)代謝及降解飼料原料中可能存在的毒素等作用（許鐠文，2012）。大量研究結(jié)果表明，植物莖葉發(fā)酵有利于植物廢棄物的高效利用，減少對環(huán)境的污染，有利于開辟新的飼料資源，具有良好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益（周昊，2014）。本研究以枸杞葉為原料，通過乳酸菌、枯草芽孢桿菌發(fā)酵，觀察發(fā)酵底物中總黃酮、有機(jī)酸、粗蛋白質(zhì)、氨基酸等物質(zhì)的含量變化，探討不同菌種發(fā)酵對枸杞葉生物活性成分含量的影響，為枸杞葉在飼料中的應(yīng)用提供參考數(shù)據(jù)。

1　材料

1.1原料與試劑枸杞葉產(chǎn)自寧夏，干燥粉碎，過60目篩；植物乳桿菌、枯草芽孢桿菌均由本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)選育；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、MRS肉湯培養(yǎng)基購買北京奧博星生物技術(shù)有限公司；蘆丁對照品（純度≥98%）購自成都曼斯特生物科技公司；沒食子酸對照品（純度≥98%）乳酸、乙酸、丙酸對照品 購自北京德威鈉生物技術(shù)有限公司；氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品（2.5 μmol/mL）購自美國Sigma公司；其他試劑均為分析純

1.2儀器與設(shè)備電子天平 梅特勒公司；高速離心機(jī) Sigma公司； GC-2010plus氣相色譜儀島津公司；UV-160紫外可見分光光度計(jì) 萊伯特公司；

2　發(fā)酵處理方法

2.1種子液制備

枯草芽孢桿菌：挑取少量凍存的枯草芽孢桿菌菌種劃線接種到已滅菌的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)24 h進(jìn)行菌種活化，然后將活化的菌種接種于已滅菌的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，置于恒溫?fù)u床中，溫度37℃，轉(zhuǎn)速180 r/min，培養(yǎng)24 h備用。

植物乳桿菌：挑取少量凍存的植物乳桿菌菌種劃線接種到已滅菌的MRS瓊脂培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)24 h進(jìn)行菌種活化，然后將活化的菌種接種于已滅菌的MRS肉湯培養(yǎng)基中，置于恒溫培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24 h備用。

2.2固體發(fā)酵試驗(yàn)

發(fā)酵條件：一定量的枸杞葉粉，初始含水量35%，接種量10%。37℃培養(yǎng)120 h。

試驗(yàn)分為三個(gè)組，A組添加10%植物乳桿菌，B組添加10%枯草芽孢桿菌，C組添加5%的植物乳桿菌和5%的枯草芽孢桿菌。

3　含量測定

3.1常規(guī)營養(yǎng)成分的測定粗蛋白質(zhì)含量測定依據(jù)GB /T 6432—1994《飼料中粗蛋白質(zhì)測定方法》；粗纖維含量測定依據(jù)GB /T 6434—2006《飼料中粗纖維的含量測定方法》；粗灰分含量測定依據(jù)GB /T 6438—2007《飼料中粗灰分的測定》；粗多糖測定按照SN/T 4206-2015方法；乳酸測定按照GB/T 23877—2009方法；水分含量測定依據(jù)GB/T 6435 - 2014《飼料中水分的測定》；氨基酸的測定依據(jù)GB /T 18246—2000《飼料中氨基酸的測定》。

3.2有機(jī)酸測定供試品溶液的制備：稱取發(fā)酵枸杞葉3.0 g于250 mL具塞錐形瓶中，準(zhǔn)確加入10 mL丙酮，蓋塞，超聲提取15 min，過濾，濾液過0.45 μm供氣相色譜用。

氣相色譜條件：檢測器：FID檢測器；溫度：270℃；進(jìn)樣口溫度：250℃；分流比：10；流速：5.0 mL/min；程序升溫：100℃（保留0.5 min）→8℃/min升到180℃（保留1 min）→20℃/min升到230℃（保留10 min）；柱子：DB-WAX。

3.3總黃酮含量測定

3.3.1供試品溶液的制備取發(fā)酵枸杞葉0.5 g于50 mL離心管中，加70%乙醇15 mL，80℃水浴80%功率超聲提取15 min，4000 r/min離心5 min，提取液減壓抽濾。將濾液定量轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，加相同濃度的乙醇定容至刻度，搖勻即得。

3.3.2對照品溶液的制備精確稱取蘆丁對照品0.005 g，置于小燒杯中，用體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇溶解并轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中定容，搖勻，即得濃度為0.200 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

3.3.3總黃酮含量的測定吸取2.00 mL 蘆丁對照品溶液和樣品試液于25 mL容量瓶中，用70%乙醇補(bǔ)充至12.5 mL，加入0.7 mL 亞硝酸鈉（1：20），搖勻，放置 5 min 后，加入 0.7 mL 硝酸鋁（1：10），6 min 后再加入 5 mL 4.3%的氫氧化鈉，混勻，用70%的乙醇定容，10 min 后在波長510 nm 處測定其吸光度，于對照品吸光度比較計(jì)算含量。

3.4總多酚含量測定

3.4.1試液的制備稱取0.5 g 粉碎的樣品于250 mL燒瓶中，準(zhǔn)確加入50.00 mL體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇溶液，提取液中鹽酸含量0.024%，攪拌均勻，在恒溫水浴鍋中安裝好回流裝置，水浴溫度75℃，提取50 min。提取液以3000 r/min離心20 min，過濾，濾液定量轉(zhuǎn)移至50 mL的容量瓶中，用60%的乙醇定容，搖勻即得供試液。

精確稱量沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品25 mg，用水溶解后定容于250 mL容量瓶中，得到0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液。分別移取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液0.00、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 mL置 于 25 mL具塞試管中，分別加入福林酚試劑1 mL，搖勻后再分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)12% Na2CO3溶液2 mL，用水定容至25 mL，搖勻。室溫下避光反應(yīng)2 h 后，在765 nm 波長下測定吸光度。

3.4.2樣品多酚含量的測定分別吸取1.00 mL多酚提取液和沒食子酸對照品溶液于25 mL具塞試管中，分別加入福林酚試劑1 mL及質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的碳酸鈉溶液2 mL并定容至刻度，在室溫下避光反應(yīng)2 h，在765 nm波長處測定吸光度，計(jì)算提取液中的多酚含量。

表1　發(fā)酵前后營養(yǎng)成分的含量變化（干物質(zhì)計(jì)）g/100g

表2　發(fā)酵前后枸杞葉中有機(jī)酸的含量變化mg/kg

4　數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果使用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)軟件，Duncan's多重比較檢驗(yàn)均值的差異顯著性，當(dāng)P＜0.05時(shí)，表示差異顯著，結(jié)果用“平均值（x）±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）”表示。

5　結(jié)果與分析

5.1不同菌種發(fā)酵對枸杞葉營養(yǎng)成分的變化

由表1可知，與對照組相比，試驗(yàn)Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組的粗蛋白質(zhì)含量增加，但差異不顯著（P＞0.05）；與對照組相比，試驗(yàn)Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組的粗纖維含量顯著增加（P＜0.05），分別增加26.65%、26.36%和26.22%；與對照組相比，試驗(yàn)Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組的粗灰分含量顯著降低（P＜0.05），分別降低6.93%、7.09%和10.13%；與對照組相比，三個(gè)試驗(yàn)組的氨基酸總量顯著降低（P＜0.05），分別降低7.01%、7.22%和8.34%；與對照組相比，試驗(yàn)Ⅰ組和Ⅲ組的天冬氨酸和谷氨酸顯著降低（P＜0.05），試驗(yàn)Ⅱ組和Ⅲ組的纈氨酸顯著降低（P＜0.05），試驗(yàn)Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組的異亮氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸顯著降低（P＜0.05），試驗(yàn)Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組甘氨酸顯著升高（P＜ 0.05）。

5.2不同菌種發(fā)酵對枸杞葉有機(jī)酸含量的影響由表2可知，與對照組相比，試驗(yàn)Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組的乙酸含量顯著升高（P＜0.05），分別增加1 380.05%、1 290.85%和1 353.32%，試驗(yàn)Ⅱ組的乙酸含量顯著低于試驗(yàn)Ⅰ組和Ⅲ組（P＜0.05）；與對照組相比，試驗(yàn)Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組的丙酸含量顯著升高（P＜0.05），分別增加465.27%、552.32%和467.42%，試驗(yàn)Ⅱ組的丙酸含量顯著高于試驗(yàn)Ⅰ組和Ⅲ組（P＜0.05）。三個(gè)試驗(yàn)組的乳酸含量均未檢出。

5.3不同菌種發(fā)酵對枸杞葉粗多糖、黃酮和多酚含量的的影響從表3可見，與對照組相比，試驗(yàn)Ⅰ組和Ⅱ組的粗多糖含量顯著降低（P＜0.05），分別降低17.30%和10.55%，試驗(yàn)Ⅲ組的粗多糖含量無顯著變化（P＞0.05）；與對照組相比，試驗(yàn)Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組的黃酮含量顯著降低（P＜0.05），分別降低49.10%、58.11%和55.86%；與試驗(yàn)Ⅰ組相比，試驗(yàn)Ⅱ組和Ⅲ組的黃酮含量較低，且差異顯著（P＜0.05）；與對照組相比，試驗(yàn)Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組的多酚含量顯著降低（P＜ 0.05），分別降低 26.67%、67.27%和 33.94%，與試驗(yàn)Ⅱ組相比，試驗(yàn)Ⅰ組和Ⅲ組的多酚含量較高，且差異顯著（P＜0.05）。

表3　發(fā)酵前后枸杞葉中粗多糖、黃酮和多酚的含量變化

6　討論

6.1枸杞葉發(fā)酵對常規(guī)營養(yǎng)成分含量的影響孫林等（2017）研究發(fā)現(xiàn)，以菜籽粕為原料，用枯草芽孢桿菌、植物乳桿菌和混菌發(fā)酵，發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白質(zhì)含量和多肽含量較發(fā)酵前均有所增加。本試驗(yàn)中，三個(gè)不同菌種發(fā)酵的枸杞葉粗蛋白質(zhì)含量都有升高的趨勢，可能是發(fā)酵用微生物本身含有的菌體蛋白，而提高了粗蛋白質(zhì)的含量（戚曉舟，2016），而粗纖維含量顯著增加和粗灰分含量顯著降低，與微生物生長代謝過程中，氧化消耗糖類物質(zhì)有關(guān)。王剛（2011）研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌發(fā)酵菜籽粕，能夠較好的把大分子的蛋白質(zhì)降解為小分子的蛋白質(zhì)、肽和氨基酸，諸葛斌等（2011）采用混菌發(fā)酵棉籽粕，發(fā)酵產(chǎn)物中的游離氨基酸含量顯著高于單個(gè)菌株發(fā)酵產(chǎn)物中的含量，且均有較大程度的提高。本試驗(yàn)結(jié)果表明，三個(gè)發(fā)酵組的氨基酸總量顯著降低，植物乳桿菌發(fā)酵組中僅有甘氨酸顯著升高，枯草芽孢桿菌發(fā)酵組僅有天冬氨酸、脯氨酸和丙氨酸顯著升高，混菌發(fā)酵組精氨酸和甘氨酸顯著升高，具體原因可能與發(fā)酵底物、菌種、接種量以及發(fā)酵工藝等相關(guān)因素有關(guān)，有關(guān)發(fā)酵對游離氨基酸的影響研究還有待進(jìn)一步探索。

6.2枸杞葉發(fā)酵對粗多糖和有機(jī)酸含量的影響由于微生物生長代謝過程中，氧化消耗糖類物質(zhì)，造成糖類物質(zhì)的減少（和小黑，2014）。本試驗(yàn)結(jié)果表明，接種植物乳酸桿菌和枯草芽孢桿菌的枸杞葉發(fā)酵產(chǎn)物中粗多糖含量顯著下降，這可能與植物乳酸桿菌和芽孢桿菌可降解植物中的碳水化合物有關(guān)（孫琦，2016）。接種混菌的枸杞葉發(fā)酵產(chǎn)物中多糖含量升高，可能是枯草芽孢桿菌生長過于迅速，在一定程度上抑制了植物乳桿菌的生長（王增元，2017），從而影響了植物乳酸桿菌降解粗多糖的能力。

單胃動(dòng)物腸道中揮發(fā)性脂肪酸主要包括乙酸、丙酸、丁酸等。乙酸存在外周血液中，對于維持正常的結(jié)腸上皮組織具有重要意義；丙酸主要參與肝臟內(nèi)的吸收與代謝，它的影響主要體現(xiàn)在對碳水化合物和膽固醇的代謝方面（毛倩，2009）。目前認(rèn)為有益微生物進(jìn)入腸道后能產(chǎn)生乳酸、乙酸、丙酸和丁酸等揮發(fā)性脂肪酸使腸內(nèi)環(huán)境酸化，從而抑制病原菌的生長繁殖，這是益生素的作用機(jī)理之一（劉輝，2008）。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三個(gè)發(fā)酵組的有機(jī)酸含量顯著高于對照組，且不同的菌種發(fā)酵產(chǎn)物中有機(jī)酸含量不同。其中，植物乳酸桿菌組的乙酸含量高于枯草芽孢桿菌組，枯草芽孢桿菌組丙酸含量高于植物乳酸桿菌組，揮發(fā)性脂肪酸含量的增加可能是生產(chǎn)性能改善的原因之一。但三個(gè)試驗(yàn)組的乳酸含量均未檢出，可能是發(fā)酵時(shí)間較短或與發(fā)酵底物有關(guān)。

6.3發(fā)酵對枸杞葉中黃酮和多酚含量的影響

本試驗(yàn)條件下，植物乳酸桿菌組、枯草芽孢桿菌組和混合發(fā)酵組的黃酮含量均顯著降低，但三個(gè)試驗(yàn)組的下降幅度不同，枯草芽孢桿菌及混合發(fā)酵的下降更為顯著。可能是發(fā)酵過程中，益生菌代謝的豐富酶系對黃酮類物質(zhì)發(fā)生了部分轉(zhuǎn)化，破壞了黃酮類化合物能發(fā)生顯色反應(yīng)的鄰苯二酚結(jié)構(gòu)（郭孝萱，2017）。徐丹等（2017）研究也表明，桑葉發(fā)酵會(huì)降低其黃酮含量，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。

7　結(jié)論

本試驗(yàn)條件下，利用植物乳桿菌、枯草芽孢桿菌單一菌種發(fā)酵或混合發(fā)酵菌種發(fā)酵枸杞葉，發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白質(zhì)、乙酸和丙酸含量提高，黃酮和多酚含量下降。