乙肝病毒X蛋白對肝星狀細胞活化的影響及可能機制

李海燕 孫 靜 楊亞娟 張逍港

(西安醫學院醫學技術系，陜西 西安 710000)

肝纖維化是肝臟組織在各種病因的損傷下發生的一種可逆的損傷修復反應，以細胞外基質(ECM)過度沉積為特點，肝星狀細胞(HSC)是ECM的主要來源。若肝纖維化得不到有效控制，最終會進展為肝硬化。在我國，乙肝病毒(HBV)感染是導致肝炎、肝硬化的主要病因。研究表明〔1，2〕，HBV編碼的X(HBx)蛋白在肝纖維化的啟動和發展中發揮了重要作用。NADPH 氧化酶(NOX)的多種亞基如NOX1、NOX2、NOX4，通過生成活性氧簇(ROS)介導了氧化應激反應，在HSC活化中發揮了重要作用〔3～5〕。轉化生長因子(TGF)-β1在各種類型的肝纖維化中，是最強的致纖維化的細胞因子。為證實HBx蛋白是否能夠活化HSC及通過何種分子活化HSC，本研究將HBx-pcDNA3.1轉染入L02肝細胞株，構建穩定轉染HBx的L02-HBx細胞株，隨后制備L02-HBx、LX-2/L02-pcDNA3.1、 LX-2/L02的條件培養基，分別孵育HSC株LX-2。檢測HSC活化標志物α-SMA、TGF-β1和NOX4的蛋白表達，進一步揭示其分子機制，探討HBx蛋白對HSC的活化和NOX分子表達的影響及TGF-β1在這個過程中所發揮的作用。

1 材料與方法

1.1細胞和試劑 人HSC株LX-2、人肝細胞株L02由中科院上海細胞庫提供；細胞孵育于培養基(由RPMI1640、10%小牛血清、100 mg/L鏈霉素、100 kU/L青霉素配制而成)，放置于5%CO2恒溫培養箱(37℃)，實驗取用對數生長期細胞。pcDNA3.1-HBx質粒(西安依科生物有限公司)、NOX4 siRNA(上海吉瑪制藥技術有限公司)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(美國 Pierce公司)、潮霉素B、SB-431542(Sigma公司，美國)、 TGF-β1酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(美國 Peprotech公司 )、兔抗人NOX4抗體，鼠抗人α-平滑肌肌動蛋白(SMA)、α-tubulin抗體(美國 Abcam公司)。

1.2HBx基因轉染L02細胞株 ①按照LipofectamineTM2000脂質轉染試劑盒說明書操作步驟，將pcDNA3.1-HBx質粒轉染入對數生長期L02細胞，陰性對照組轉染空pcDNA3.1質粒。②轉染48 h，細胞以1∶10比例稀釋后，重新鋪24孔板。經適當濃度潮霉素B選擇培養2 w，種至96孔板。③挑取較大單克隆，消化后擴大增殖至24孔板培養，最終擴大至6孔板培養，直至可進行Western印跡實驗檢測HBx蛋白表達，建立L02-HBx細胞株。

1.3ELISA檢測L02-HBx細胞培養上清中TGF-β1的表達 收集L02-HBx、L02-pcDNA3.1(陰性對照組)、L02細胞株(空白對照組)24 h的培養基，離心，吸取上清液，嚴格按照Peprotech公司TGF-β1 ELISA試劑盒說明書操作，酶標儀450 nm波長測量各孔吸光值。

1.4制備穩定轉染HBx蛋白的肝細胞條件培養基 分別將三組細胞株以1×105密度接種于6孔板，待細胞培養至80%～90%融合度時更換為不含小牛血清的RPMI1640培養液，48 h后吸取培養基，離心后取上清液即為條件培養基。

1.5Western印跡檢測條件培養基孵育的HSC中NOX4和α-SMA蛋白的表達 將LX-2細胞以1×105密度接種于6孔板，待細胞培養至80%～90%融合度時更換為不含小牛血清的RPMI1640培養液，饑餓24 h。再以上述制備的L02-HBx條件培養基作用于饑餓后的LX-2細胞，陰性對照組為L02-pcDNA3.1條件培養基，空白對照組為L02條件培養基。處理24 h后，以含有1/100苯甲基磺酰氟(PMSF)的RIPA細胞裂解液溶解細胞，提取蛋白，并以BCA法定量。蛋白變性、上樣，行SDS-PAGE電泳，恒壓80 V，30 min后轉恒壓120 V 90 min，蛋白轉PVDF膜，轉膜75 min，封閉1 h，洗膜后分別與封閉液稀釋的特異一抗于4℃孵育過夜，PBST洗膜30 min，二抗孵育，室溫1 h，PBST洗20 min，化學發光法顯影。實驗平行重復3次。

1.6Western印跡檢測NOX4敲減后HSC中α-SMA及NOX4蛋白表達 以NOX4 siRNA轉染 L02-HBx條件培養基孵育的LX-2細胞，轉染介質為LipofectamineTM2000脂質轉染試劑盒，陰性對照組轉染無關siRNA序列，空白對照組不加干擾序列。轉染24 h后，提取上述3組細胞的總蛋白，進行Western印跡檢測，方法同上。實驗平行重復3次。

1.7Western印跡檢測加入TGF-β1受體抑制劑后NOX4蛋白的表達 將L02-HBx條件培養基分為3組，分別為：10 μmol/L SB-431542處理組，PBS處理組，未加處理組。將以上3組條件培養基孵育LX-2細胞24 h后，提取上述3組細胞的總蛋白，進行Western印跡檢測NOX4蛋白的表達，方法同上。實驗平行重復3次。

1.8統計學方法 采用SPSS13.0統計學軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1肝細胞中HBx蛋白的表達 L02-HBx細胞中有相對分子質量17 kD的條帶出現，而其余兩組細胞中無此條帶出現(圖1)，說明L02-HBx細胞可以穩定表達HBx蛋白。

2.2L02-HBx細胞培養上清液中TGF-β1的表達 L02-HBx組、陰性對照組及空白對照組細胞培養上清液中TGF-β1的表達量分別為(2 913.55±579.82)、(209.40±69.36)、(230.57±55.76)pg/ml，L02-HBx細胞培養上清中TGF-β1的表達量顯著高于其他兩組(均P<0.01)。

2.3L02-HBx的條件培養基孵育HSC后，NOX4和α-SMA的蛋白表達 與L02-HBx共培養的LX-2細胞(LX-2/L02-HBx)中NOX4(179.98±20.96)和α-SMA蛋白(180.27±18.05)表達均顯著高于陰性對照組(105.71±13.47，89.7±14.37)和空白對照組(111.8±24.82，93.66±18.42，P<0.01)，見圖2。

2.4敲減NOX4后HSC中α-SMA蛋白的表達 LX-2/ L02-HBx+si-NOX4組中隨著NOX4表達(125.78±12.04)的下調，α-SMA的表達(121.81±33.89)也顯著低于陰性對照組(244.33±14.61，216.06±20.1)和空白對照組(242.04±25.28，221.46±27.34，P<0.05)，見圖3。

2.5在L02-HBx的條件培養基中加入TGF-β1受體抑制劑后NOX4蛋白的表達 加入SB-431542的L02-HBx的條件培養基，孵育過的LX-2中NOX4蛋白表達(53.04±9.39)顯著低于空白對照組(122.07±12.44，P<0.05)，見圖4。

1.L02-HBx;2.陰性對照組;3.空白對照組圖1 肝細胞中HBx蛋白的表達

1.LX-2/L02-HBx;2.陰性對照組;3.空白對照組圖2 不同條件培養基孵育后，LX-2中NOX4和α-SMA蛋白的表達

1.LX-2/L02-HBx+si-NOX4;2.陰性對照組;3.空白對照組圖3 敲減NOX4后HSC中α-SMA和NOX4蛋白的表達

1.LX-2/L02-HBx+ SB-431542;2.空白對照組圖4 L02-HBx條件培養基中加入SB-431542后NOX4蛋白的表達

3 討 論

HBV感染是慢性肝炎、肝硬化、肝細胞癌的重要致病因素之一，但其發病機制尚未完全闡明。HBx蛋白由HBV DNA中一個最小的開放閱讀框架編碼而成，由154個氨基酸組成，是一個多功能的調節因子。研究認為HBx蛋白在肝細胞癌的發生發展中發揮了重要作用〔6〕，如：它可以通過調節肝癌細胞轉錄、干擾正常肝細胞修復、影響多種細胞信號通路等方式，從而調控肝癌細胞的生長、增殖、侵襲與轉移。HSC是肝纖維化病理過程中ECM的主要細胞來源，它的活化在肝纖維化疾病進展中發揮重要作用。目前，很多研究者致力于HBV導致肝纖維化機制的研究，結果表明〔7，8〕，HBV可以通過多種途徑啟動HSC的活化，而HBx蛋白可以促進其增殖并使其在肝纖維化的病理過程中發揮作用，但HBx活化HSC的具體機制尚未完全闡明。以往研究顯示〔9，10〕，NOX4在肝纖維化的大鼠模型中表達增加，尤其在HSC中的表達顯著高于對照。Lan等〔5〕揭示NOX4通過介導多條細胞信號通路，誘導HSC的持續激活。但NOX4在乙肝相關的肝纖維化中是否對HSC的活化發揮重要作用尚未有文獻報道。TGF-β1是公認的最強致纖維化的細胞因子，它誘導發生肝纖維化的主要機制有：促進ECM的合成及抑制其降解、直接激活HSC、誘導肝細胞通過EMT轉變為成纖維細胞等〔11〕。但TGF-β1在乙肝相關的肝纖維化中是否調節NOX4的表達，進而影響HSC的活化尚需進一步實驗證實。為了更好地模擬人感染HBV后，肝細胞與HSC所發生的病理生理過程，本課題的研究對象區別于以往國內外所使用的HepG2、 SMMC-7721等肝癌細胞株，以具有正常肝細胞形態功能的L02肝細胞株及人正常HSC株LX-2為研究對象，結果顯示L02-HBx細胞條件培養基孵育的LX-2細胞中，α-SMA和NOX4的蛋白表達明顯增高，TGF-β1在L02-HBx細胞條件培養基中的表達量也明顯增高。因此課題組做出如下假設：表達了HBx蛋白的肝細胞可以通過旁分泌TGF-β1的方式上調NOX4，NOX4進一步促進HSC的活化，從而促進肝纖維化的發生。

本研究利用si-NOX4干擾了L02-HBx條件培養基孵育的LX-2細胞后，檢測其表達及活化情況，結果表明隨著NOX4蛋白表達的下調，HSC活化標志物α-SMA的表達也部分地下調，這表明在乙肝相關的肝纖維化中，NOX4與α-SMA的表達具有一定的相關性，NOX4在HSC的活化中發揮了一定作用，在L02-HBx細胞條件培養基中加入TGF-β1的受體阻斷劑后，細胞中NOX4的表達顯著降低。本研究屬體外實驗，故而其結論有待進一步的動物實驗進一步加以驗證。

4 參考文獻

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