ACM復(fù)合rBMSC修復(fù)兔股骨內(nèi)髁關(guān)節(jié)軟骨缺損的價(jià)值

劉 拴 張明勇 胡 冰

(武漢科技大學(xué)附屬天佑醫(yī)院骨科，湖北 武漢 430064)

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 48只3月齡健康新西蘭白兔，雌雄各半，購(gòu)自南京模式動(dòng)物研究所。

1.2試劑與材料 注射用鹽酸氯胺酮(北京雙鶴藥業(yè)股份有限公司)；鹽酸異丙嗪注射液(成都倍特藥業(yè)有限公司)；鹽酸利多卡因注射液(山西晉新雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司)；免疫組化SP試劑盒(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所)；Ⅱ型膠原一抗(上海美迪西生物醫(yī)藥有限公司)；胎牛血清(北京生物制品研究所)；注射用青霉素鈉(桂林南藥股份有限公司)；乙二胺四乙酸、多聚甲醛、DMEM以及胰蛋白酶均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。脫細(xì)胞軟骨支架材料為本實(shí)驗(yàn)室自行制成，經(jīng)常規(guī)消毒等處理后保存于干燥環(huán)境中。

1.3儀器設(shè)備 手術(shù)各操作器械、實(shí)驗(yàn)臺(tái)等由本實(shí)驗(yàn)室提供；二氧化碳培養(yǎng)箱(Hcracus公司)；相差倒置顯微鏡(德國(guó)AFM公司)；組織包埋機(jī)及切片機(jī)(泰維科技有限公司)；顯微攝影成像系統(tǒng)(徠卡公司)；數(shù)碼相機(jī)(德國(guó)萊次公司)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1組織工程軟骨的制作 采用密度梯度離心和差速貼壁法獲得原代兔BMSC，在培養(yǎng)期間，進(jìn)行光鏡觀察2次。當(dāng)細(xì)胞間隙變大，出現(xiàn)漩渦狀孔隙時(shí)添加等體積FBS將胰酶中和，吸出細(xì)胞液后將瓶壁上細(xì)胞層反復(fù)沖洗，制成單細(xì)胞懸液。吸取懸液15 ml，離心3 min，棄上清，加入DMEM液重懸單細(xì)胞懸液，經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。取豬膝關(guān)節(jié)軟骨，經(jīng)清洗、冷凍和干燥處理后分為骨粉末，使用胰酶消化和清洗，消毒后待用。取無(wú)菌ACM手工切成4 mm×4 mm×3 mm體積大顆粒，分別放入6孔板中，將稀釋至1×106個(gè)/ml的BMSC單細(xì)胞懸液，滴加至6孔板中，37℃、5%二氧化碳飽和濕度條件下孵育2 h。

1.4.2膝關(guān)節(jié)軟骨缺損動(dòng)物模型的制作和修復(fù) 48只新西蘭白兔，隨機(jī)分為3組，ACM-BMSC組，ACM組，空白對(duì)照組。各個(gè)組再分為6 w和12 w時(shí)間點(diǎn)。將新西蘭白兔稱(chēng)重后，記錄重量，根據(jù)重量，注射鹽酸氯胺酮2 ml/kg，每只新西蘭白兔注射一支鹽酸異丙嗪，注射方式為臂肌注射；對(duì)于膝關(guān)節(jié)區(qū)目標(biāo)手術(shù)部位先脫毛后再牢固固定，常規(guī)消毒之后給予1%利多卡因麻。于兔膝關(guān)節(jié)前內(nèi)側(cè)入路，暴露膝關(guān)節(jié)，屈曲膝關(guān)節(jié)，充分暴露股骨內(nèi)側(cè)踝。制造軟骨缺損3 mm深，達(dá)軟骨下骨且能夠感覺(jué)到有突破感、孔內(nèi)滲血。將組織工程化骨植入缺損部位并壓滿。伸直術(shù)側(cè)膝關(guān)節(jié)后復(fù)位髕骨，縫合切口。術(shù)后追加使用抗生素，青霉素80萬(wàn)U/d。新西蘭白兔分開(kāi)飼養(yǎng)，自由活動(dòng)。

1.5主要觀察指標(biāo) 6 w、12 w時(shí)分別處死8只新西蘭白兔，取出膝關(guān)節(jié)標(biāo)本仔細(xì)觀察。將動(dòng)物標(biāo)本常規(guī)使用4%多聚甲醛固定后使用EDTA脫鈣3個(gè)月，常規(guī)制備石蠟切片，經(jīng)HE染色和免疫組化染色后在光鏡下觀察。同時(shí)進(jìn)行Wakitani組織學(xué)評(píng)分。Wakitani組織學(xué)評(píng)分：分為細(xì)胞形態(tài)、基質(zhì)染色、表面平整、軟骨厚度、接合、總分。細(xì)胞形態(tài)，全部為透明軟骨為0分，大多數(shù)為透明軟骨為1分，主要是纖維軟骨為2分，大多數(shù)不是透明軟骨為3分，無(wú)透明軟骨為4分。基質(zhì)染色，正常為0分，略有減少為1分，顯著減少為2分，其他為3分。表面平整，平整超過(guò)3/4為0分，居中(1/2～3/4)為1分，不規(guī)則為2分，非常不規(guī)則為3分。軟骨厚度大于2/3為0分，1/3～2/3為1分，不足1/3為2分。接合，接合較好為0分，只有1邊接合為1分，均不接合為2分。總分：滿分14分，分值越低，軟骨缺損修復(fù)越好。

其中：被解釋變量Lapro為勞動(dòng)生產(chǎn)率。解釋變量Time為時(shí)間虛擬變量，表示最低工資標(biāo)準(zhǔn)實(shí)施前后，實(shí)施前為0，實(shí)施后為1。解釋變量Treat表示是否落實(shí)最低工資標(biāo)準(zhǔn)的虛擬變量，落實(shí)為1，未落實(shí)為0。Time×Treat表示解釋變量Time和Treat的乘積，系數(shù)β3表示最低工資標(biāo)準(zhǔn)對(duì)于企業(yè)勞動(dòng)生產(chǎn)率的影響。控制變量X表示影響企業(yè)勞動(dòng)生產(chǎn)率的其他因素，包括企業(yè)特征和所在地區(qū)經(jīng)濟(jì)發(fā)展水平。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物大致觀察分析 三組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物關(guān)節(jié)腔沒(méi)有看到感染積液，沒(méi)有發(fā)生關(guān)節(jié)腔粘連情況。術(shù)后6 w：ACM-BMSC組，與附近正常組織新生軟骨完全填充，表面基本接合，表面光滑、乳白色；ACM組新生軟骨不完全填充，與附近正常組織有所接合，表面不光滑、偏白色；空白對(duì)照組新生軟骨填充很少，與附近正常組織不接合，表面裂隙較多、偏白色；術(shù)后12 w：ACM-BMSC組完全修復(fù)，與附近正常組織完全接合，表面光滑、乳白色；ACM組不完全修復(fù)，與附近正常組織接合處仍有裂隙，表面不光滑、偏白色；空白對(duì)照組修復(fù)較少，與附近正常組織不接合，表面裂隙較多、偏白色。術(shù)后6 w和12 w關(guān)節(jié)缺損部位直接觀察結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 關(guān)節(jié)缺損部位觀察

2.2術(shù)后關(guān)節(jié)組織學(xué)觀察 術(shù)后6 w ACM-BMSC組修復(fù)組織與周?chē)M織接合良好，表層可見(jiàn)梭形成纖維細(xì)胞，縱軸與表面平行，修復(fù)細(xì)胞呈圓形透明軟骨樣細(xì)胞，基質(zhì)染色與周?chē)＼浌腔|(zhì)比較有所下降，潮線清晰。ACM組修復(fù)組織與周?chē)M織有所接合，表層細(xì)胞層次排列紊亂，深層可見(jiàn)成纖維樣細(xì)胞修復(fù)，細(xì)胞深層可見(jiàn)透明軟骨樣細(xì)胞，基質(zhì)染色與周?chē)＼浌腔|(zhì)比較明顯下降，潮線無(wú)。空白對(duì)照組無(wú)明顯類(lèi)軟骨組織修復(fù)，僅有少量類(lèi)肉芽組織。術(shù)后12 w ACM-BMSC組修復(fù)組織與周?chē)M織接合良好，表層可見(jiàn)梭形成纖維細(xì)胞，縱軸與表面平行，修復(fù)細(xì)胞呈圓形透明軟骨樣細(xì)胞，基質(zhì)染色與天然軟骨組織接近，潮線清晰。ACM組修復(fù)組織與周?chē)M織有所接合，表層細(xì)胞層次排列紊亂，深層可見(jiàn)成纖維樣細(xì)胞，修復(fù)細(xì)胞深層可見(jiàn)透明軟骨樣細(xì)胞，基質(zhì)染色與周?chē)＼浌腔|(zhì)比較明顯下降，潮線無(wú)。空白對(duì)照組無(wú)明顯類(lèi)軟骨組織修復(fù)，僅有少量類(lèi)肉芽組織。見(jiàn)圖2。

2.3Wakitani組織學(xué)評(píng)分比較 在同一時(shí)間段內(nèi)，不同組間細(xì)胞形態(tài)、基質(zhì)染色、表面平整、軟骨厚度、接合、總分比較，ACM-BMSC組和空白對(duì)照組、ACM組和空白對(duì)照組比較，差異顯著(P<0.05)；ACM-BMSC組和ACM組比較無(wú)差異顯著(P>0.05)。見(jiàn)表1。

圖2 術(shù)后關(guān)節(jié)組織學(xué)觀察(HE，×100)

時(shí)間組別細(xì)胞形態(tài)基質(zhì)染色表面平整軟骨厚度接合總分6 wACM-BMSC組1.49±0.441)1.39±0.461)0.79±0.661)0.59±0.611)0.79±0.641)4.99±1.221)ACM組1.79±0.471)1.59±0.481)0.89±0.571)0.59±0.481)0.88±0.541)5.79±0.881)空白對(duì)照組2.49±0.331.58±0.471.88±0.540.88±0.571.79±0.468.59±1.2212 wACM-BMSC組1.29±0.481)0.99±0.411)0.88±0.471)0.49±0.491)0.77±0.411)4.43±1.441)ACM組1.49±0.471)1.38±0.441)0.79±0.411)0.59±0.481)0.88±0.541)5.09±1.551)空白對(duì)照組2.29±0.441.49±0.371.99±0.751.09±0.331.49±0.378.39±1.11

與空白對(duì)照組比較：1)P<0.05

3 討 論

組織工程學(xué)作為一門(mén)以細(xì)胞生物學(xué)與材料學(xué)核心內(nèi)容的新興學(xué)科，其主要通過(guò)重新構(gòu)建組織器官修復(fù)和改善疾病，主要分為種子細(xì)胞、生物材料和體內(nèi)微環(huán)境等內(nèi)容〔4～7〕。目前，軟骨細(xì)胞、充質(zhì)干細(xì)胞是臨床上主要使用的細(xì)胞類(lèi)型。在大量人體和動(dòng)物試驗(yàn)中均有實(shí)踐證明，國(guó)內(nèi)的多項(xiàng)研究也證實(shí)自體軟骨細(xì)胞在其中有更好的軟骨成骨效果〔8～10〕。而異體軟骨細(xì)胞雖然能夠通過(guò)包裹基質(zhì)被植入，但卻容易遭到自然殺傷細(xì)胞的攻擊。有研究指出，若采用同種異體軟骨細(xì)胞復(fù)合的支架材料進(jìn)行關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)，有確切效果，在一定程度上豐富了種子細(xì)胞的來(lái)源〔11，12〕。間充質(zhì)干細(xì)胞具備多種分化的潛能，且若應(yīng)用BMSC不僅取材來(lái)源與操作方便，對(duì)供體也不會(huì)產(chǎn)生明顯影響，分離培養(yǎng)十分方便，體外增殖能力也十分理想，來(lái)源也不受限制〔13〕。

目前，組織工程中支架材料主要包括兩種，一種是天然生物可降解材料，另一種是人工合成生物可降解材料〔14,15〕。組織工程支架材料需要有良好的生物相容性和降解性，具備三維多孔立體結(jié)構(gòu)，要有一定的機(jī)械強(qiáng)度。在軟骨組織工程中，支架材料則應(yīng)該有足夠的孔隙結(jié)構(gòu)，促進(jìn)細(xì)胞黏附和增殖，可以通過(guò)表面修飾等，對(duì)細(xì)胞的黏附和生長(zhǎng)進(jìn)行調(diào)控〔16〕。還需要具備一定的彈性，支架還需要能夠和周?chē)慕M織融為一體，不容易缺損和脫落。當(dāng)然，這些都是理想狀態(tài)的要求，至今尚未發(fā)現(xiàn)存在。

本文所獲得的BMSC作為種子細(xì)胞，生長(zhǎng)良好，純度較高。生物材料方面，細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)作為軟骨支架材料中的重要部分，具備連接、支持等作用。通過(guò)處理后，ACM最大程度保留了細(xì)胞賴(lài)以生存的細(xì)胞外基質(zhì)，與生物天然軟骨基質(zhì)成分十分接近，適合細(xì)胞生存。近幾年，細(xì)胞和支架的接種技術(shù)的不斷發(fā)展，臨床上已經(jīng)出現(xiàn)了沉淀法、浸漬法、吸附法等多種技術(shù)。本文結(jié)果顯示脫細(xì)胞軟骨支架材料在解剖和組織結(jié)構(gòu)上均基本達(dá)到了本研究預(yù)期的修復(fù)目標(biāo)，但其修復(fù)細(xì)胞的排列方式和正常軟骨細(xì)胞依然存在一定的區(qū)別。研究更為完美的修復(fù)方法有著更為重要的實(shí)踐價(jià)值。

4 參考文獻(xiàn)

1Rumberger LK,Lewis J.Chronic expanding hematoma of the thigh masquerading as a soft tissue malignancy〔J〕.Am Surg,2015;81(7):279-81.

2Tsuka T,Morita T,Tanaka H,etal.Nasal tissue-derived hamartoma in the maxillary gingiva of a calf〔J〕.BMC Vet Res,2016;12(1):19.

3李 新,于曉華,吳耀義,等.早期跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)SD大鼠股骨內(nèi)髁軟骨缺損修復(fù)的影響〔J〕.中國(guó)矯形外科雜志,2014;22(16):1492-7.

4Crespi R,Capparé P,Gastaldi G,etal.Reactive soft tissue preservation in large bone defects after tooth extractions:a cone beam study〔J〕.Int J Oral Maxillofac Implants,2016;31(1):179-85.

5Glibert M,De Bruyn H,Ostman PO.Six-year radiographic,clinical,and soft tissue outcomes of immediately loaded,straight-walled,platform-switched,titanium-alloy implants with nanosurface topography〔J〕.Int J Oral Maxillofac Implants,2016;31(1):167-71.

6劉志勇,陳 磊,費(fèi)志強(qiáng),等.兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合納米羥基磷灰石/左旋聚乳酸修復(fù)兔軟骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.中國(guó)現(xiàn)代手術(shù)學(xué)雜志,2013;17(3):166-70.

7Aloy-Prósper A,Pearrocha-Oltra D,Pearrocha-Diago M,etal.Peri-implant hard and soft tissue stability in implants placed simultaneously versus delayed with intraoral block bone grafts in horizontal defects:a retrospective case series study〔J〕.Int J Oral Maxillofac Implants,2016;31(1):133-41.

8Dolan RT,Butler JS,Wilson-MacDonald J,etal.Quality of life and surgical outcomes after soft-tissue reconstruction of complex oncologic defects of the spine and sacrum〔J〕.J Bone Joint Surg Am,2016;98(2):117-26.

9劉利兵,王成偉,高 健,等.微骨折技術(shù)與骨軟骨移植治療關(guān)節(jié)軟骨缺損〔J〕.中國(guó)組織工程研究,2013;17(31):5735-40.

10余家闊.膝關(guān)節(jié)軟骨全層缺損的常用修復(fù)方法〔J〕.中華關(guān)節(jié)外科雜志(電子版),2010;4(6):708-22.

11Sanei-Moghaddam A,Sanei-Moghaddam A,Kahrobaei S.Lateral soft tissue X-ray for patients with suspected fishbone in oropharynx,a thing in the past〔J〕.Iran J Otorhinolaryngol,2015;27(83):459-62.

12Angarita FA,Cannell AJ,Abdul Razak AR,etal.Trabectedin for inoperable or recurrent soft tissue sarcoma in adult patients:a retrospective cohort study〔J〕.BMC Cancer,2016;16(1):30.

13陳其春,鄒月芬,王德杭,等.磁共振T_2-mapping成像在膝關(guān)節(jié)早期骨性關(guān)節(jié)炎中的應(yīng)用〔J〕.臨床放射學(xué)雜志,2012;31(1):81-5.

14孫 皓,左 健.組織工程化軟骨細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞用于修復(fù)同種異體關(guān)節(jié)軟骨缺損〔J〕.中國(guó)組織工程研究,2012;16(19):3602-5.

15儲(chǔ) 淼,孫立勝,蔣 青.不同年齡兔前交叉韌帶切斷后關(guān)節(jié)軟骨變化的研究〔J〕.中國(guó)微創(chuàng)外科雜志,2012;12(7):659-63.

16劉效仿,張 健,侯 蕾,等.透明質(zhì)酸促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.中國(guó)矯形外科雜志,2015;23(24):2271-6.