Vaspin對高脂喂養小鼠肝臟脂質聚集的影響

吳光秀 周澤華 孫建娟 唐 亮 熊 那 唐 亮 況小璐 肖 蓉

(重慶涪陵中心醫院內分泌科，重慶 408000)

脂肪組織不但是機體最主要的能量儲存器官，而且是重要的內分泌組織，分泌多種細胞因子，在維持機體能量代謝平衡及內環境穩態中發揮著極其重要的作用〔1〕。Vaspin是內臟脂肪組織來源的絲氨酸蛋白酶抑制劑，是新近從一種2型糖尿病大鼠(OLETF rat)的內臟白色脂肪組織中發現并分離的脂肪細胞因子，廣泛表達于脂肪、肝臟、胃、下丘腦等組織〔2～4〕。研究發現Vaspin與肥胖、胰島素抵抗、動脈粥樣硬化、2型糖尿病(T2DM)及其并發癥等明顯相關〔5～10〕。Vaspin能夠提高小鼠基礎代謝率，抑制肝糖生成，改善胰島素抵抗，提高胰島素敏感性〔1,11〕。然而，Vaspin對高脂飲食誘導肝臟脂肪聚集的影響尚不完全清楚。本研究擬利用小鼠源性Vaspin重組蛋白，研究外源性Vaspin對高脂飲食喂養誘導的小鼠肝臟脂肪聚集的調節，以研究Vaspin生物學功能及其調節機體代謝的分子機制。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 小鼠源性Vaspin蛋白購自瑞士Enzo公司；小鼠普通飼料購于第三軍醫大學附屬大坪醫院野戰外科研究所實驗動物中心，高脂飼料購于江蘇美迪森生物醫藥有限公司，其中普通飼料含脂肪19%，碳水化合物60%；高脂飼料含脂肪45%，碳水化合物35%。聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)測定試劑盒購自碧云天生物科技有限公司；胰島素測定試劑盒購自武漢優而生生物科技有限公司；RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒及熒光染料SyberGreen Ⅱ均購自Takara公司，各檢測基因引物均由上海Invitrogen公司合成；兔抗小鼠Vaspin單克隆抗體購自英國Abcam公司，兔抗小鼠β-actin抗體及辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG抗體均購自中杉金橋生物科技公司。

1.2模型構建及樣本 健康雄性C57BL/6J小鼠48只，鼠齡7 w，適應性喂養1 w后，隨機分為普食組(NC)及高脂組(HC)，分別喂養16 w。于14 w末分別給予兩組腹腔注射生理鹽水(200 μl/只)或鼠源性Vaspin蛋白(劑量：2 mg/kg)，1次/d，共2 w；即NC組(普食+生理鹽水組)，NV組(普食+Vaspin組)，HC組(高脂+生理鹽水組)，HV組(高脂+Vaspin組)；各12只。喂養期間小鼠在籠中可以自由活動，飲水和飼料均充足，每日晝夜周期為8 am～8 pm，室內溫度保持(22±2)℃。

1.3肝組織提取與保存 小鼠斷頸處死，75%醫用酒精消毒手術區域3次，利用無菌剪刀剪開小鼠腹壁，暴露肝臟；更換無菌剪刀快速、輕柔離斷肝臟，利用預冷的無菌生理鹽水洗滌組織殘留血液，利用濾紙吸干殘留液體，用剪刀剝離附屬膽囊等組織后部分立即保存于液氮罐，部分直接保存于4%多聚甲醛液體。

1.4肝組織HE染色 4%中性多聚甲醛固定的肝臟標本，常規石蠟包埋、切片、二甲苯和系列梯度酒精脫水；之后利用蘇木精、伊紅染色。干燥后于普通顯微鏡下進行觀察。

1.5肝臟三酰甘油(TG)測定 測定試劑盒購自北京普利萊基因技術有限公司，操作過程按照說明書通過酶法檢測組織總TG含量。

1.6基礎生化代謝指標測定 小鼠禁食10 h后，摘除眼球取血至含有肝素抗凝劑的Eppendorf管中，離心后收集血漿樣本，-80℃保存待測。空腹血糖采用葡萄糖氧化酶法測定；TG、總膽固醇(TC)、游離脂肪酸(FFA)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)均用酶法測定；血漿胰島素采用酶聯免疫吸附法檢測。

1.7血漿Vaspin測定 空腹血漿Vaspin(武漢優而生生物科技公司，編號：SEA706Mu)采用雙抗體夾心酶聯免疫法檢測；測定過程嚴格按照試劑盒說明書進行，其中小鼠血漿采用試劑盒所提供樣品稀釋液進行1∶4稀釋。

1.8實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測基因mRNA表達 用Trizol法提取肝臟總RNA，取1 μg逆轉錄為cDNA。采用RT-PCR檢測各目的基因表達，利用2-△△Ct值計算目的基因的相對表達量，實驗重復3次。各目的基因引物序列如下：β-actin:上游引物-5′GTAAAGACCTCTATGCCAACA-3′,下游引物-5′-GGACTCATCGTACTCCTGCT-3′； 肝臟乙酰輔酶A羧化酶(ACC):上游引物-5′AGCAGTTACACCACATACAT-3′,下游引物-5′GTCATCACCATCTTCATTACC-3′；脂肪酸合成酶(FAS):上游引物-5′CTCATCCACTCAGGTTCAG-3′,下游引物- 5′AGGTATGCTCGCTTCTCT-3′； 肉毒堿棕櫚酰轉移酶(CPT)-1:上游引物-5′AGCCAGACGAAGAACATC-3′，下游引物- 5′CCTTGACCATAGCCATCC-3′； 激素敏感性脂肪酶(HSL):上游引物-5′AAGACCACATCGCCCACA-3′，下游引物-5′CTGAAGGCTCTGAGTTGCT-3′。

1.9肝臟組織Vaspin蛋白表達測定 利用蛋白裂解液放射免疫沉淀(RIPA)及蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟(PMSF)等裂解肝臟，低溫12 000 r/min離心30 min。之后，吸取上清通過BCA法檢測總蛋白濃度。取100 μg蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，經濕轉轉于聚偏氟乙烯(PVDF)膜，室溫封閉1 h后，依次加入稀釋的一抗、二抗反應并洗脫，通過電化學發光成像系統進行成像，以各目的蛋白與內參β-actin條帶灰度值之比表示目的蛋白的相對表達量。

1.10統計學方法 采用SPSS20.0統計軟件進行t檢驗、ANOVA分析。

2 結 果

2.1各組肝臟Vaspin表達水平變化 與NC組比較，HC組肝臟Vaspin mRNA及蛋白表達明顯增高(P<0.01)；NV組及 HV組肝臟Vaspin mRNA及蛋白表達顯著高于NC組、HC組(P<0.01)。見圖1和表1。

圖1 各組肝臟組織Vaspin mRNA及蛋白相對表達量

組別Vaspin mRNAVaspin蛋白NC組1.00±0.101.00±0.11NV組14.82±1.371)6.27±0.651)HC組4.91±0.421)3.68±0.381)HV組15.36±1.732)6.69±0.592)

與NC組相比:1)P<0.01;與HC組相比：2)P<0.01；表3同

2.2各組基礎代謝指標 與NC組比較，HC組體重、FBG、TG、TC、FFA、LDL-C、FIns及血漿Vaspin水平明顯升高，而HDL-C水平顯著降低(P<0.05或P<0.01)。HV組體質量、FBG、TG、TC、FIns、LDL-C和FFA明顯低于HC組；而HDL-C及血漿Vaspin濃度高于HC組(P<0.01)。見表2。

2.3各組肝臟脂肪聚集程度 HC組肝細胞脂質空泡明顯形成，并伴大量炎癥細胞聚集；與HC組相比較，HV組肝臟脂質空泡數量及相對面積均明顯減少。見圖2。

2.4各組肝臟脂質代謝關鍵基因變化 與NC組比較，HC組ACC、FAS mRNA表達增高，而HSL、CPT-1明顯降低(P<0.01)，HV組ACC、FAS mRNA表達明顯低于HC組(P<0.01)， 而CPT-1、HSL表達水平明顯高于HC組(P<0.01)；NC組及NV組ACC、FAS、HSL及CPT-1表達差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表2 各組基礎生化指標比較

與NC組比較：1)P<0.05,2)P<0.01;與HC組比較：3)P<0.01

圖2 各組小鼠肝臟脂質聚集程度(×100)

組別ACCFASCPT-1HSLNC組1.00±0.091.00±0.101.00±0.121.00±0.10NV組1.02±0.111.09±0.980.97±0.091.12±0.12HC組3.96±0.401)4.03±0.481)0.61±0.091)0.50±0.061)HV組1.96±0.172)2.36±0.212)1.13±0.122)1.26±0.132)

3 討 論

Vaspin是2005年首次報道的一種主要由腹腔脂肪組織合成、分泌的絲氨酸蛋白酶抑制劑，屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑家族成員之一〔1〕。臨床研究表明肥胖、T2DM及胰島素抵抗人群血清中或內臟脂肪組織中Vaspin水平較健康人群均明顯升高，而且升高幅度與糖脂代謝指標、胰島素敏感性等相關指標密切相關〔5～10,12〕。另外，近期的一些研究表明，不論是外周還是中樞 Vaspin蛋白或過表達載體輸注均可以降低鼠空腹血糖，抑制高脂飲食誘導的肥胖鼠的食欲及肝糖生成，從而提高系統胰島素敏感性；然而，抑制或敲除Vaspin表達能夠進一步加重高脂飲食喂養或基因誘導所致的糖代謝紊亂〔2,4,11,13〕。近來，國內外學者一致認為胰島素抵抗是糖脂代謝等代謝紊亂性疾病的共同病理生理基礎，胰島素抵抗與肥胖緊密相關〔14〕。

過多的脂肪攝入是機體糖脂代謝紊亂的最主要環境危險因素。高脂喂養是目前誘導肥胖、高脂血癥及肝臟非酒精性脂肪性肝病的通用手段〔15〕。

本研究顯示，在高脂誘導肥胖及胰島素抵抗大鼠其內在脂肪組織Vaspin 的 mRNA 及蛋白水平均明顯增高；其他多項臨床研究發現升高的血漿或組織Vaspin表達與肥胖、胰島素抵抗及T2DM的發生發展密切相關，且隨著胰島素敏感或肥胖程度的改善，Vaspin表達明顯降低甚至降至正常水平〔5～10〕。與此研究結果一致的是，本研究研究顯示高脂喂養16 w能夠明顯誘導血漿Vaspin水平及肝臟組織Vaspin的mRNA、蛋白表達。推斷Vaspin的表達升高可能是機體對高脂飲食所誘導的糖脂代謝負荷的代償性調節，在一定程度上有益于肥胖及胰島素抵抗的改善。

動物研究發現Vaspin 基因表達上調鼠能夠顯著提高肥胖小鼠的糖耐量水平，降低小鼠體重，調節胰島素作用信號通路〔2,11〕。與此相一致的是，本研究結果顯示Vaspin慢性持續輸注能夠明顯抑制高脂飲食喂養所誘導的肝臟脂肪細胞變性程度及肝臟TG含量蓄積。這進一步有力說明了Vaspin對糖、脂代謝紊亂均有明顯的改善作用。然而，Vaspin輸注對普通飲食喂養的小鼠肝臟脂質聚集無明顯影響，這可能是由于Vaspin發揮生理作用具有明顯的內環境依賴性。

本研究結果表明Vaspin蛋白輸注能夠抑制高脂喂養誘導肝臟脂肪合成關鍵分子FAS、ACC的mRNA表達，而顯著促進脂肪分解限制酶HSL、CPT-1的表達，然而，Vaspin蛋白輸注對普通飲食喂養組脂肪代謝關鍵分子的表達無明顯影響。因此，Vaspin可能通過抑制肝臟脂肪合成、促進脂肪分解代謝而抑制肝臟脂肪蓄積，從而降低高脂飲食所誘導的體重增加。Vaspin基因表達增多可能通過中樞特定神經核團活性而調節肝糖生成即胰島素敏感性〔13〕，然而，對于Vaspin表達上調是間接通過中樞調節肝臟脂質聚集或直接調節肝臟脂肪代謝及Vaspin調節脂代謝的具體機制需要深入研究。

4 參考文獻

1Flier JS.Obesity wars:molecular progress confronts an expanding epidemic〔J〕.Cell,2004;23;116(2):337-50.

2Hida K,Wada J,Eguchi J,etal.Visceral adipose tissue-derived serine protease inhibitor:a unique insulin-sensitizing adipocytokine in obesity〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A,2005;102(30):10610-5.

3Korner A,Neef M,Friebe D,etal.Vaspin is related to gender,puberty and deteriorating insulin sensitivity in children〔J〕.Int J Obes(London),2011;35(4):578-86.

4Kloting N,Kovacs P,Kern M,etal.Central vaspin administration acutely reduces food intake and has sustained blood glucose-lowering effects〔J〕.Diabetologia,2011;54(7):1819-23.

5Aust G,Richter O,Rohm S,etal.Vaspin serum concentrations in patients with carotid stenosis〔J〕.Atherosclerosis,2009;204(1):262-6.

6Belin EJ,Ali MI,Mintz J,etal.Obesity induced-insulin resistance causes endothelial dysfunction without reducing the vascular response to hindlimb ischemia〔J〕.Basic Res Cardiol,2009;104(6):707-17.

7Seeger J,Ziegelmeier M,Bachmann A,etal.Serum levels of the adipokine vaspin in relation to metabolic and renal parameters〔J〕.J Clin Endocrinol Metab,2008;93(1):247-51.

8Kloting N,Berndt J,Kralisch S,etal.Vaspin gene expression in human adipose tissue:association with obesity and type 2 diabetes〔J〕.Biochem Biophys Res Commun,2006;339(1):430-6.

9Teshigawara S,Wada J,Hida K,etal.Serum vaspin concentrations are closely related to insulin resistance,and rs77060950 at SERPINA12 genetically defines distinct group with higher serum levels in Japanese population〔J〕.J Clin Endocrinol Metab,2012;97(7):E1202-7.

10Youn BS,Kloting N,Kratzsch J,etal.Serum vaspin concentrations in human obesity and type 2 diabetes〔J〕.Diabetes,2008;57(2):372-7.

11Nakatsuka A,Wada J,Iseda I,etal.Visceral adipose tissue-derived serine proteinase inhibitor inhibits apoptosis of endothelial cells as a ligand for the cell-surface GRP78/voltage-dependent anion channel complex〔J〕.Circ Res,2013;112(5):771-80.

12Gkiomisi A,Makedou KG,Anastasilakis AD,etal.Serum vaspin levels in women with and without gestational diabetes mellitus during pregnancy and postpartum〔J〕.Cytokine,2013;61(1):127-32.

13Luo X,Li K,Zhang C,etal.Central administration of vaspin inhibits glucose production and augments hepatic insulin signaling in high-fat-diet-fed rat〔J〕.Int J Obes (Lond),2016;40(6):947-54.

14Bray GA.Medical consequences of obesity〔J〕.J Clin Endocrinol Metab,2004;89(6):2583-9.

15Marchesini G,Bugianesi E,Forlani G,etal.Nonalcoholic fatty liver,steatohepatitis,and the metabolic syndrome〔J〕.Hepatology,2003;37(4):917-23.