姜黃素對結腸癌細胞Caco2中MACC-1及PGE2的影響

賈 佳 趙 逵 陳 濤

(湖北醫藥學院附屬人民醫院，湖北 十堰 470000)

姜黃素及其衍生物的抗腫瘤作用發展前景無限。結腸癌是我國的常見的消化道腫瘤之一。結腸癌轉移相關因子(MACC-1)是一個新的癌基因，通過全基因細胞分析被Stein等〔1〕研究者發現，在胃癌〔2〕、肝癌〔3〕、胰腺癌〔4〕、子宮內膜癌〔5〕、食管癌〔6〕等的發生、發展及轉移起到至關重要的作用。MACC-1是肝細胞生長因子(HGF)激活配體的原癌基因，并且能夠調控HGF受體(c-Met)所介導的信號通路成為該通路的關鍵調控因素。前列腺素(PG)E2，是花生四烯酸轉化的生物活性物質，在許多腫瘤的原發灶、轉移灶中高表達，尤其在結腸癌中表達更為突出。本實驗研究姜黃素對結腸癌細胞Caco2增殖及對MACC-1及PGE2蛋白表達的影響。

1 材料和方法

1.1藥物和試劑 姜黃素、MTT(Sigma公司)；胎牛血清、改良型1640培養基、胰蛋白酶(Hylone公司)；DMSO(貴陽恒因生物)；兔抗人多克隆MACC-1(Abcam公司)，β-actin引物、大鼠抗人多克隆c-Met抗體(Santa Cruz 公司)；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒、辣根酶標記鼠抗兔IgG(H+L) (北京博奧森生物技術有限公司)；β-actin多克隆抗體(小鼠來源)、辣根酶標記山羊抗小鼠IgG(H+L) (北京中杉金橋公司)。

1.2方法

1.2.1細胞培養 人結腸癌細胞株Caco2購自中科院上海細胞所，細胞培養：結腸癌細胞Caco2，接種于含10%胎牛血清改良型1640培養基中培養，置于37℃、5%CO2、100%濕度培養箱中培養，隔天換液，待細胞長至對數生長期時，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2MTT法檢測姜黃素對Caco2細胞增殖的抑制 取對數生長期的Caco2 細胞，設空白組、對照組、姜黃素組，調整細胞濃度為2.0×106個/ml，接種于96孔板中，分別加入5、10、20、40、60、80、100、120 μmol/L，設5個復孔，對照組加入培養基，培養48 h，每孔加入20 μl 0.5%的MTT 溶液，繼續培養4 h，每孔加入150 μl DMSO，低速振蕩10 min，酶標儀讀取A490 值，計算出半數致死量(IC50)。

1.2.3ELISA檢測PGE2 取對數生長期細胞，按5×104個/孔，每孔500 μl培養液，分別接種于24孔板中，培養24 h貼壁后，加入 48 μmol/L姜黃素，每個時間點均設對照組，培養箱中培養，于6、12、24、48 h取上清入滅菌過的EP管中，取上清液100 μl/孔按ELISA試劑盒操作說明書進行實驗，每個樣品設復孔。

1.2.4Western印跡法檢測Caco2細胞中c-Met與MACC-1 蛋白的表達 用48 μmol/L姜黃素處理Caco2細胞，培養6、12、24和48 h，并設陰性對照，提取總蛋白后，再用BCA定量試劑盒進行總蛋白定量，樣品20 μl上樣，加入緩沖液電泳，轉膜，再封閉，加一抗雜交(c-Met與MACC-1、β-actin)及相應二抗，暗盒中曝光后進行顯影和定影，用凝膠圖像分析系統對結果進行分析。

1.3統計學方法 采用SPSS13.0軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1不同藥物濃度對人結腸癌細胞Caco2增殖的影響 同對照組比較，隨著姜黃素濃度增加，OD值隨之顯著降低，存在量效關系(P<0.05)，并測得姜黃素對Caco2細胞的IC50為49.5 μmol/L，見圖1。

2.2不同時點細胞上清液PGE2水平 對照組隨時間的延長，上清液中PGE2水平不斷增加，加入48 μmol/L姜黃素干預后，上清液中PGE2水平明顯下降，與同時點對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05),見表1。

圖1 不同濃度姜黃素對Caco2細胞48 h生長增殖的影響

組別6 h12 h24 h對照組61.934 9285.391 08170.117 60姜黃素組23.283 201)31.338 851)45.178 651)

與同時點對照組比較：1)P<0.05

2.3姜黃素對Caco2細胞中c-Met與MACC-1蛋白表達的影響 姜黃素濃度48 μmol/L干預Caco2細胞6、12、24和48 h時c-Met與MACC-1蛋白均較對照組表達逐漸降低(圖2)，差異有統計學意義(P<0.05，P<0.01)，見表2。

圖2 姜黃素對Caco2細胞中MACC-1及c-Met蛋白表達的影響

組別MACC-1c-Met對照組0.924 0±0.147 70.714±0.065姜黃素6 h組0.686 8±0.111 51)0.614±0.0551)姜黃素12 h組0.476 3±0.171 51)0.584±0.0351)姜黃素24 h組0.281 8±0.130 81)0.367±0.0351)姜黃素48 h組0.092 0±0.044 72)0.125±0.0352)

與同時點對照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01

3 討 論

姜黃素聯合維生素C，對胃腫瘤細胞SGC-7901周期 有明顯的抑制作用〔7〕。張建中等〔8〕研究顯示姜黃素對胃腫瘤細胞SGC-7901的抑制作用可能是通過抑制IKK途徑降低IκBα的降解從而抑制核因子(NF)-κB通路的激活。化療藥物能夠殺滅腫瘤，但對正常的細胞也具有殺傷作用，所以在抗腫瘤的治療中盡量減少化療藥物的用量。本實驗證實，姜黃素能夠抑制體外結腸癌Caco2細胞的增殖，呈劑量依賴性，隨著劑量的增加，腫瘤細胞明顯被抑制。PGE2 能促進細胞的增殖、分化，也能促進腫瘤血管的形成，抑制腫瘤細胞凋亡，抑制有免疫調節功能的淋巴因子產生，抑制T細胞、B細胞的增殖、腫瘤壞死因子(TNF)的產生；可誘導白細胞介素(IL)-10產生〔9～11〕。因此，應用環氧化酶抑制劑姜黃素可減輕腫瘤引起的免疫抑制作用及PGE2蛋白表達的下降，說明姜黃素有可能抑制了TNF-α，這與相關研究〔12〕結果一致，PGE2對腫瘤壞死因子具有抑制作用。PGE2是脂質信號分子發揮著各種功能，如發熱、血管擴張、子宮收縮、刺激成骨細胞的吸收等一系列作用，研究顯示〔13〕15-羥基前列腺素脫氫酶(15-PDGH)是PGE2生物活性氧化酶，能夠綁定PG因子，促進造血干細胞的改善、炎癥恢復。研究顯示〔14〕在結腸癌LOVO中，PGE2能上調β-catenin和VEGF的蛋白表達，從而激活wnt信號通路，而PGE2抑制wnt/β-catenin時，VEGF的表達無異常，說明PGE2對VEGF的調節可能是通過另一途徑。本實驗結果說明姜黃素能夠降低PGE2的含量，可能是通過抑制wnt/β-catenin等信號通路。MACC-1是HGF和c-Met信號通路的重要調控者，在原位癌、轉移灶等惡性腫瘤中高度表達，促進腫瘤的發展、抑制凋亡，而在正常組織中不表達或低表達〔15〕。研究顯示，MACC-1能夠控制Met啟動子的活性和表達，MACC-1轉染后能夠誘導Met表達；MACC-1 siRNA 治療后導致Met 基因被敲除〔1，3〕。研究顯示〔16〕，在胃癌細胞中MACC-1能夠促進腫瘤的增殖、轉移和侵襲，以研究顯示〔17～19〕評估胃癌患者MACC-1預后的重要性存在沖突，包括陰性及預后不良的影響。研究顯示〔16〕，胃癌患者中MACC-1和Met蛋白過度表達與兩者低表達相比較顯示出低生存率，然而，其他研究顯示〔20〕這兩組在生存率上無差異。而顯示，MACC-1與總生存率及無事件生存率的相關性是獨立的，而Met與上述指標不相關，也支持一項假說——在進展期的胃癌患者起重要作用的是MACC-1信號通路，因此，這項研究顯示在胃癌組織中MACC-1表達是臨床預后的不利因素，而不是Met，盡管Met是MACC-1眾所周知的靶基因，但結果遠非如此〔21〕。本實驗顯示姜黃素能夠抑制MACC-1及Met蛋白的表達，呈時間依賴性，可能是因為抑制MACC-1蛋白表達，從而影響了HGF/c-Met的信號通路，抑制了Caco2細胞的增殖，根據Wha等〔21〕研究結果可以推斷，抑制MACC-1蛋白比抑制Met蛋白更有利于結腸癌患者的預后。MACC-1可作為結腸癌患者轉移、生存及預后的生物標志物，在Lemos等〔22〕的實驗中首次提出，MACC-1所調控的信號通路與腫瘤干細胞的相關性是通過誘導多樣性干細胞標志物Nanog、Oct4實現的，因此，MACC-1能夠促進腫瘤的進展及轉移可能是通過干細胞的信號通路MACC-1/Nanog/Oct4軸而實現，為靶向性及干預治療提供了新的選擇。

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