杜仲總黃酮對去卵巢大鼠骨組織代謝的影響

李三華 陳全利 楊加強

(遵義醫科大學，貴州 遵義 563099)

絕經后骨質疏松(PMOP)主要原因是絕經后卵巢合成的雌激素減少，進而導致的內分泌紊亂造成骨吸收增多而使骨形成和骨吸收的平衡被打破。杜仲具有補肝腎、強筋骨之功效。前期試驗發現杜仲總黃酮(TFE)在體外具有促進大鼠成骨樣細胞增殖和護骨素mRNA表達等作用〔1～3〕。本文擬分析TFE對去卵巢大鼠骨組織代謝的影響。

1 材料與方法

1.1材料 6月齡SD雌性大鼠購自第三軍醫大學大坪醫院實驗動物中心，杜仲購自遵義市中藥材市場；戊酸雌二醇(拜耳醫藥保健有限公司)；大鼠Ⅰ型前膠原氨基端肽(PINP)酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒和β-Ⅰ型膠原交聯羧基末端肽(β-CTXⅠ)ELISA試劑盒(上海西唐生物科技有限公司)；體視顯微鏡(德國LEICA，M125)；小動物雙能X射線骨密度儀(美國Faxitron，DHX)。

1.2TFE的提取 杜仲樹皮粉碎成粉末后過60目篩，精密稱重1 kg，加入60%乙醇1.2 L，在微波功率200 W條件下加熱提取20 min，過濾，提取2次，合并濾液，減壓旋轉蒸發后烘干至恒重得到杜仲皮提取物；再經AB-8大孔吸附樹脂純化，采用70%乙醇洗脫、富集、濃縮干燥得到TFE 38 g，總黃酮用無菌雙蒸水配制成混懸液備用。

1.3骨質疏松大鼠模型的制作 6月齡雌性SD大鼠36只，隨機選取30只按30 mg/kg 的劑量腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，仰臥固定于手術臺，常規消毒備皮后于腹腔下部正中切開約1 cm長切口，找出雙側卵巢并摘除，術畢傷口內注射硫酸慶大霉素1萬U，縫合肌肉皮膚并常規消毒。余下6只切開腹腔不摘除卵巢并縫合腹腔作為假手術組。

1.4動物分組及處理 去卵巢手術1 w后，30只去卵巢大鼠隨機平均分為模型組、TFE低、中、高劑量組和雌二醇組，假手術組和模型組只自由進食飲水；TFE低、中、高劑量組在自由進食飲水的基礎上，分別灌胃50、100、200 mg·kg-1·d-1TFE，持續5 d/w；雌二醇組在自由進食飲水的基礎上，每周灌胃2次戊酸雌二醇，每次1.5 mg/kg體重。實驗處理持續12 w。

1.5觀察指標 實驗結束后麻醉處死大鼠，腹主動脈取血，室溫無菌靜置凝固1 h,2 000 r/min離心10 min收集血清，按ELISA試劑盒說明書測定血清PINP和β-CTXⅠ的濃度；取右側股骨于小動物雙能X射線骨密度儀上測量骨密度和骨礦物質含量；取右側脛骨經不脫鈣切片后進行VanGieson染色于顯微鏡下觀察骨膠原的表達，測量粉紅色染色區域面積在骨組織中的面積比(骨膠原面積比)。

1.6統計學方法 采用SPSS13.0軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1TFE對去卵巢大鼠血清指標的影響 與假手術組相比，模型組PINP和β-CTXⅠ水平均顯著增加(P<0.05)；與模型組相比，TFE中、高劑量組PINP濃度顯著升高(P<0.05)，TFE中、高劑量組及雌二醇組β-CTXⅠ濃度顯著降低(P<0.05)。見表1。

2.2TFE對去卵巢大鼠骨組織的影響 與假手術組比較,模型組、TFE低、中、高劑量組和雌二醇組股骨骨密度、骨礦物質含量和脛骨骨膠原面積均明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，TFE中、高劑量組骨密度和骨膠原面積比顯著回升(P<0.05)；TFE各組骨礦物質含量均顯著增加(P<0.05)。模型組和TFE低劑量組骨膠原比較稀疏，TFE中、高劑量組和雌二醇組骨膠原增多，分布較為密集，見表1，圖1。

表1 各組血清和骨組織指標比較

1)與假手術組比較，2)與雌二醇組比較，3)與TEF高劑量組比較，4)與TEF中劑量組比較，5)與TEF低劑量組比較：均P<0.05

圖1 各組骨膠原VanGieson染色(標尺長度2 mm)

3 討 論

雌激素在骨生長、礦化和細胞的分化及功能活性中發揮重要作用；隨著年齡的增加，女性雌激素水平下降，成骨細胞的數量和活性逐漸下降，而破骨細胞的數量和活性逐漸增強，導致骨高轉換且骨吸收活動強于骨形成，因而骨密度降低，骨的顯微結構退變和骨質丟失，進而導致骨的脆性增加，骨折風險增高。雌激素降低是導致絕經期婦女骨質疏松的重要原因，對于PMOP的治療，臨床上多以補充外源性雌激素的方法即傳統的雌激素替代治療和選擇性雌激素受體調節劑(SERM)為主要方法,但都有一定的副作用，增加卵巢癌、子宮內膜癌等疾病的風險〔4，5〕。黃酮類物質是植物雌激素的一種，廣泛存在于蔬菜、水果和藥用植物等中。杜仲中的黃酮類物質主要包含槲皮素、山奈酚、紫云英苷和蘆丁〔6，7〕，筆者前期實驗提示TFE可能具有防治骨質疏松的功效〔1～3〕。

骨是持續進行骨重建的動態器官，骨重建過程包括成骨細胞成骨和破骨細胞溶骨；PINP 和β-CTX能夠快速且靈敏地反映骨形成和骨吸收的狀態，動態反映機體內骨重建的狀況〔8〕。骨密度是指骨礦物質密度，反映骨形成和骨吸收的平衡狀態，骨密度檢測是預測絕經后骨丟失的靈敏指標之一，是判定骨質疏松的“金標準”〔9〕。骨膠原是骨有機質的主要成分，不僅為骨的礦化提供基本場所，還與骨細胞的發育、生長和活性調節有關，其含量、結構和穩定性直接影響骨微結構和骨生力學特性,對維持骨的質量有重要作用。本實驗揭示了雌激素缺乏的大鼠其骨形成和骨吸收都在增強的骨高轉換特點；且雌激素缺乏后骨的吸收活動強于骨形成；TFE可能抑制了骨吸收同時也促進了骨的形成。本文結果表明TFE對雌激素缺乏SD大鼠的骨組織具有保護作用。

4 參考文獻

1李三華，何志全，陳全利，等.杜仲總黃酮對大鼠成骨細胞護骨素表達的影響〔J〕.安徽農業科學,2011；39(25)：15279-82.

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3李三華，莫寧萍，劉坤祥，等.RT-PCR法檢測杜仲總黃酮對大鼠成骨細胞骨鈣素表達的影響〔J〕.遵義醫學院學報,2011；8(34)：1-3.

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