鹽酸小檗堿對人腺樣囊性癌ACC2細胞增殖及周期的影響

司 熙 孔晨飛 王曉峰

(海南醫學院第一附屬醫院口腔科，海南 海口 570102)

腺樣囊性癌多發于涎腺，占涎腺腫瘤5%～10%，患者以中老年女性為主〔1〕。其發生使患者口腔干燥、疼痛，進食困難。又因好發于頜面部而影響美觀，極大降低患者生活質量。目前臨床治療以手術切除為主，輔以放療和化療，但復發率較高。因此需要尋找新的富有療效的化療藥物。小檗堿是從中藥黃連中分離的一種季銨生物堿，廣泛應用于解熱鎮痛、抗菌及胃腸道疾病的治療。近年來，研究發現其還具有抗腫瘤的作用〔2～4〕。本文擬觀察鹽酸小檗堿對人腺樣囊性癌ACC2細胞的生長抑制作用和對細胞周期的影響。

1 材料與方法

1.1材料與儀器 鹽酸小檗堿(BBI生命科學公司)；CCK8(bimake公司)、細胞培養液DMEM(美國Gibco公司)、胰蛋白酶(美國Gibco公司)、凋亡試劑盒及周期試劑盒(南京凱基生物公司)、流式細胞儀(美國BD公司)、酶標儀(美國Bio-Tektr公司)等。

1.2細胞株 人腺樣囊性癌ACC2細胞由吉林大學中日聯誼醫院科研中心提供。采用含有10%胎牛血清及抗生素的DMEM培養基，在37℃，5%CO2的培養箱內進行培養。細胞每3 d傳代一次，傳代時用濃度為0.25%的胰酶溶液進行消化，取對數生長期的細胞進行實驗。

1.3CCK8法檢測鹽酸小檗堿對人腺樣囊性癌ACC2細胞生長的抑制率 細胞以1×104/孔的密度接種于96孔板內，培養24 h后棄去培養液并加入濃度為1、5、10、15、20 μg/ml的鹽酸小檗堿100 μl。另設對照孔，對照孔中加入培養液100 μl和稀釋藥物等量的二甲基亞砜(DMSO)。每組設有3個復孔，將細胞培養24 h后每孔加入CCK8 10 μl，繼續培養2 h后于酶標儀上檢測450 nm的吸光度(OD值)，實驗分別重復3次。記錄結果計算各濃度鹽酸小檗堿對細胞的抑制率(IR)，計算公式：抑制率(%)=(對照孔OD值-加藥孔OD值)/對照孔OD值×100%。

1.4細胞周期檢測 細胞以5×105/ml密度接種于6孔培養板內，培養24 h后加入不同濃度鹽酸小檗堿的DMEM培養液，對照組加入等量的DMSO，培養24 h后消化細胞，4℃磷酸鹽緩沖液(PBS)懸浮細胞，加入濃度為70%的乙醇溶液固定24 h后加入RNAase，在37℃水浴加熱30 min，加入碘化丙啶進行熒光染色，后上機分析。

1.5細胞凋亡檢測 細胞以5×105/ml密度接種于6孔培養板內，培養24 h 后，用不含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶進行消化并收集細胞。同樣用4℃ PBS洗滌后進行離心收集，用100 μl結合緩沖液重懸細胞并加入5 μl Annexin V-FITC，37℃避光孵育15 min。再向細胞混懸液中加入5 μl碘化丙啶(PI)作用5 min后上機檢測。實驗重復3次。

1.6統計學分析 應用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析，IC50 計算采用線性回歸。

2 結 果

2.1鹽酸小檗堿對人腺樣囊性癌ACC2細胞增殖的抑制作用 不同濃度的鹽酸小檗堿對人腺樣囊性癌ACC2細胞有著不同程度的體外抑制作用，同時也表現為一定程度的劑量依賴性(P<0.05)。鹽酸小檗堿的藥物濃度分別為1、5、10、15、20 μg/ml的細胞存活率分別為(97.14±1.25)%、(80.72±0.86)%、(59.37±1.51)%、(37.08±1.74)%、(13.86±0.85)%，較對照組(100.00%)差異有統計學意義(P<0.05,P<0.01)。鹽酸小檗堿的濃度與抑制率之間的線性回歸分析為，R2=0.991 8，Y=-0.018 6x2-3.992 2x+101.15，根據公式最后所得IC50=12.13 μg/ml，IC30=7.50 μg/ml、IC15=4.00 μg/ml。

2.2鹽酸小檗堿對人腺樣囊性癌ACC2細胞周期的影響 作用24 h后，3組與對照組相比表現為G1期減少，S、G2期增加(P<0.05)，見表1。

表1 鹽酸小檗堿對人腺樣囊性癌ACC2細胞周期的影響

與對照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01

2.3鹽酸小檗堿對人腺樣囊性癌ACC2細胞誘導凋亡的作用 作用24 h，細胞凋亡率分別為(7.5±0.7)%、(14.2±1.5)%、(23.1±1.8)%，與對照組(3.1±1.6)%相比顯著增加(P<0.05,P<0.01)。

3 討 論

涎腺腺樣囊性癌目前臨床治療以手術切除為主，對于中晚期和復發性腫瘤常加以化療。目前已有多項研究評估了多種化療藥對涎腺腺樣囊性癌的療效，但至今仍未找到特效化療藥。例如，5-氟尿嘧啶是一種應用較久的化療藥，用于治療乳腺癌及胃腸道腫瘤〔5〕。Tannock等〔6〕嘗試將其應用于涎腺腺樣囊性癌，但結果并不理想，有效率僅為33%。順鉑是一種重要的一線化療藥，廣泛應用于乳腺癌、肝癌、睪丸癌、卵巢癌、膀胱癌和頭頸部腫瘤等各種惡性腫瘤的治療〔7〕。Licitra等〔8〕應用順鉑治療中晚期及復發性涎腺腺樣囊性癌發現有效率僅為15%。而在De Haan等〔9〕觀察的10例應用順鉑治療的患者中，竟無一有效。其他常用化療藥如吉西他濱、米托蔥醌、多柔比星等對涎腺腺樣囊性癌均無明顯的療效。

小檗堿的抗腫瘤活性在多種腫瘤的研究中得到了證實，部分研究已經涉及機制。Singh等〔2〕發現小檗堿能夠降低惡性黑色素瘤細胞中前列腺素E2、前列腺素E2受體和環氧合酶2的表達，從而抑制細胞遷移。在前列腺癌PC-3細胞系中，小檗堿能夠通過誘導活性氧簇(ROS)的產生而導致細胞凋亡〔3〕。另外，在乳腺癌MCF-7細胞系中，小檗堿還能夠通過抑制AMPK-HIF通路逆轉缺氧所導致的耐藥〔4〕。

細胞凋亡是一種重要的生命現象，與腫瘤的發生、發展及預后均有密切關系。細胞凋亡的發生涉及線粒體途徑、死亡受體介導的外部凋亡途徑、B粒酶途徑等多種途徑〔10〕。本研究證實了鹽酸小檗堿對涎腺腺樣囊性癌細胞具有良好的抑制作用。本文結果顯示發現小檗堿能夠引起細胞周期停滯于S期，并且能夠誘導ACC2細胞發生凋亡，且二者均呈現出劑量依賴性。其誘導細胞凋亡的機制仍不明確，需要進一步研究。

4 參考文獻

1Renehan A，Gleave EN，Hancock BD，etal.Long-term follow-up of over 1000 patients with salivary gland tumours treated in a single centre〔J〕.Br J Surg，1996;83(12)：1750-4.

2Singh T，Vaid M，Katiyar N，etal.Berberine，an isoquinoline alkaloid，inhibits melanoma cancer cell migration by reducing the expressions of cyclooxygenase-2，prostaglandin E(2) and prostaglandin E(2) receptors〔J〕.Carcinogenesis，2011;32(1)：86-92.

3Meeran SM，Katiyar S，Katiyar SK.Berberine-induced apoptosis in human prostate cancer cells is initiated by reactive oxygen species generation〔J〕.Toxicol Appl Pharmacol，2008;229(1)：33-43.

4Pan Y，Shao D，Zhao Y，etal.Berberine reverses hypoxia-induced chemoresistance in breast cancer through the inhibition of AMPK-HIF-1alpha〔J〕.Int J Biol Sci，2017;13(6)：794-803.

5Ghiringhelli F，Apetoh L.Enhancing the anticancer effects of 5-fluorouracil：current challenges and future perspectives〔J〕.Biomed J，2015;38(2)：111-6.

6Tannock IF，Sutherland DJ.Chemotherapy for adenocystic carcinoma〔J〕.Cancer，1980;46(3)：452-4.

7Duan X，He C，Kron SJ，etal.Nanoparticle formulations of cisplatin for cancer therapy〔J〕.Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol，2016;8(5)：776-91.

8Licitra L，Marchini S，Spinazze S，etal.Cisplatin in advanced salivary gland carcinoma.A phase Ⅱ study of 25 patients〔J〕.Cancer，1991;68(9)：1874-7.

9De Haan LD，De Mulder PH，Vermorken JB，etal.Cisplatin-based chemotherapy in advanced adenoid cystic carcinoma of the head and neck〔J〕.Head Neck，1992;14(4)：273-7.

10李 敏，林 俊.細胞凋亡途徑及其機制〔J〕.國際婦產科學雜志，2014；41(2)：102-7.