胃癌患者血漿miRNA-21的表達(dá)水平及意義

姜 雷 代 強(qiáng) 梁曉磊 關(guān)泉林 趙 鵬 汪曉煒

(蘭州大學(xué)第一醫(yī)院腫瘤外科，甘肅 蘭州 730000)

胃癌已成為一類嚴(yán)重危害我國(guó)人民健康的疾病〔1〕。胃癌的發(fā)病原因尚未完全明了，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為是環(huán)境與基因交互作用的結(jié)果。miRNA是一類分布廣泛的小的非編碼蛋白質(zhì)的RNAs，其功能是調(diào)控基因表達(dá)，在腫瘤中發(fā)揮著相當(dāng)于癌基因或抑癌基因的作用，調(diào)節(jié)著腫瘤細(xì)胞的多種重要生物學(xué)行為〔2〕。研究表明miRNA-21在胃癌患者的組織中高表達(dá)〔3〕，現(xiàn)有研究已證實(shí)外周血和組織來(lái)源的miRNA的表達(dá)譜是一樣的，提示檢測(cè)血漿中的miRNA有望成為診斷和判斷惡性腫瘤預(yù)后的非損傷性分子標(biāo)志物〔4〕。本研究將采用qRT-PCR的方法檢測(cè)胃癌患者和健康人群血漿中miRNA-21的表達(dá)量，探討其表達(dá)量與胃癌臨床病理特征的相關(guān)性及診斷胃癌的準(zhǔn)確性。

1 資料與方法

1.1病例及標(biāo)本 收集蘭州大學(xué)第一醫(yī)院腫瘤外科2014年6月至2015年6月期間胃癌患者的血漿標(biāo)本共59例，同時(shí)收集44例健康對(duì)照者血漿標(biāo)本。所有胃癌病例均有詳細(xì)的臨床病理資料，所有標(biāo)本經(jīng)病理學(xué)檢查明確診斷為胃癌。所有的胃癌患者手術(shù)前未接受化療、放療、生物治療等其他治療。胃癌患者和健康對(duì)照人群在年齡、性別差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。血漿標(biāo)本制作流程：抽取外周血5 ml置于含EDTA 抗凝的取血管中，靜置30 min，4℃下1 300 r/min離心15 min，取上層澄清血漿至另一RNAse-free Eppendorf管，10 000 r/min 離心15 min 后取上層血漿每300 μl 分裝至RNAse-free Eppendorf 管，液氮速凍后置于-80℃冰箱保存，同時(shí)收集患者的臨床病理資料。

1.2實(shí)驗(yàn)方法 采用Trizol (Invitrogen)提取胃癌患者血漿中的總RNA。采用天根FastQuant RT Kit逆轉(zhuǎn)錄，qRT-PCR法定量miRNA-21，以U6 miRNA作為對(duì)照。miRNA-21引物：UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA；U6引物：CTCGCTTCGGCAGCACA。使用miRcute 增強(qiáng)型miRNA 熒光定量檢測(cè)試劑盒(SYBR Green)和其通用反向引物。各樣本的△Ct 值=(目的基因 Ct值-內(nèi)參基因Ct值)，以U6為內(nèi)參基因，各樣本基因表達(dá)相對(duì)定量值為2-△Ct。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，相關(guān)性采用Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1miRNA-21在胃癌患者及健康對(duì)照者血漿中的表達(dá)量 miRNA-21在胃癌患者血漿中的相對(duì)表達(dá)量為30.041±4.214，明顯高于健康對(duì)照者(27.993±4.488，P=0.014)。

2.2miRNA-21血漿表達(dá)水平與胃癌患者臨床病理特征的相關(guān)性 胃癌患者miRNA-21血漿表達(dá)水平與胃癌患者的性別(P=0.437)、年齡(P=0.982)、分化程度(P=0.082)、TNM分期(P=0.402)、浸潤(rùn)深度(P=0.658)及腫瘤大小(P=0.255)無(wú)明顯的相關(guān)性；而與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)(P=0.010)。見(jiàn)表1。

2.3血漿miRNA-21的表達(dá)水平診斷胃癌的準(zhǔn)確性 曲線下的面積(AUC)=0.641，95%CI(0.531～0.751)，敏感度為52.5%，特異度為75%，提示血漿miRNA-21的表達(dá)水平診斷胃癌具有較好的準(zhǔn)確性，見(jiàn)圖1。

表1 miRNA-21的表達(dá)水平與胃癌患者臨床病理特征的相關(guān)性

圖1 血漿miRNA-21的表達(dá)水平診斷胃癌的準(zhǔn)確性

3 討 論

miRNA-21是一種與惡性腫瘤相關(guān)的miRNAs，主要參與基因的表達(dá)調(diào)控，是唯一在所有惡性腫瘤均高表達(dá)的miRNAs〔5〕。但是既往研究對(duì)胃癌miRNA-21的研究主要集中在腫瘤組織或腫瘤細(xì)胞，組織活檢或是切片屬于創(chuàng)傷性檢查，而血液標(biāo)本采集為非創(chuàng)傷性檢查手段，更符合機(jī)體的生理病理狀況，有助于動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)機(jī)體的病情變化。外周血miRNA的表達(dá)譜可構(gòu)成識(shí)別癌癥與其他疾病的“指紋”，可用于腫瘤的篩查診斷、分型分類、療效預(yù)測(cè)及預(yù)后判斷等領(lǐng)域〔6〕。本研究表明胃癌患者血漿中miRNA-21的表達(dá)量高于健康人群，用于胃癌的早期診斷。加之血漿中的miRNA還非常穩(wěn)定，檢測(cè)方法簡(jiǎn)單、定量準(zhǔn)確、標(biāo)本采集方便、檢測(cè)成本低廉，有很大的臨床應(yīng)用前景。

Zhang等〔7〕用實(shí)時(shí)定量PCR 方法證實(shí)了miRNA-21 在人胃癌組織及細(xì)胞株中顯著高表達(dá)，miRNA-21高表達(dá)會(huì)顯著增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力，而敲除miRNA-21會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡顯著增加，增殖、侵襲和遷移能力會(huì)明顯下降，RECK基因可能是miRNA-21基因的作用靶點(diǎn)，體外實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)抑制miRNA-21的表達(dá)可以增加抑癌基因PTEN的表達(dá)，降低腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲能力，而增強(qiáng)miRNA-21的表達(dá)則產(chǎn)生相反的效果〔8〕，而且PTEN mRNA的3′-UTR區(qū)存在miRNA-21的直接結(jié)合位點(diǎn)，miRNA-21通過(guò)與之結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)PTEN的表達(dá)，參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展〔9〕。一項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探討了miRNA-21在淋巴瘤發(fā)生中的作用，發(fā)現(xiàn)miRNA-21高表達(dá)的小鼠約半數(shù)3個(gè)月后表現(xiàn)出淋巴瘤的特征，對(duì)照組卻沒(méi)有此現(xiàn)象，當(dāng)降低miRNA-21的表達(dá)水平后，表現(xiàn)為淋巴瘤的小鼠腫瘤逐漸退化，仍然存活了3個(gè)月，該試驗(yàn)表明miRNA-21在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用，提示抑制miRNA-21可能會(huì)成為腫瘤治療的一種新方法〔10〕。

有研究表明miRNA-21還可能是預(yù)測(cè)惡性腫瘤患者生存時(shí)間的分子標(biāo)志物，通過(guò)檢測(cè)舌鱗狀細(xì)胞癌患者miRNA-21的表達(dá)與臨床特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)高表達(dá)的miRNA-21意味著不良預(yù)后〔11〕。Gao等〔12〕學(xué)者的研究也表明：血漿和組織中miRNA-21的表達(dá)水平可以預(yù)測(cè)肺癌輔助化療的療效，miRNA-21還可以用來(lái)預(yù)測(cè)該類患者的無(wú)疾病復(fù)發(fā)生存時(shí)間。Jiang等〔13〕學(xué)者的研究也表明miRNA-21還可能是預(yù)測(cè)晚期胃癌患者預(yù)后較好的分子標(biāo)記物，miRNA-21表達(dá)水平較低的患者往往總生存時(shí)間較長(zhǎng)。本研究表達(dá)血漿miRNA-21的高表達(dá)，與淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移相關(guān)。Motoyama等〔14〕對(duì)49例胃癌患者的腫瘤組織檢測(cè)發(fā)現(xiàn) miRNA-21的表達(dá)與腫瘤大小和浸潤(rùn)深度相關(guān)，而Wu等〔15〕的研究卻表明miRNA-21 的表達(dá)水平與胃癌患者的臨床病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度無(wú)相關(guān)性。因此血漿 miR-21 的表達(dá)水平與胃癌患者臨床病理特征之間的相關(guān)性尚待大樣本的臨床研究進(jìn)一步證實(shí)。Tsujiura等〔16〕研究結(jié)果顯示：miRNA-21的表達(dá)量診斷胃癌的敏感度為60.9%，特異度為63.3%，AUC為0.673；一篇meta分析也定量評(píng)價(jià)了miRNA-21的表達(dá)水平診斷胃癌的準(zhǔn)確性，該研究共納入了5篇病例對(duì)照試驗(yàn)，meta分析合并后結(jié)果顯示，miRNA-21的表達(dá)量診斷胃癌的敏感度為66.5%，特異度為83.1%〔17〕；Wu等〔15〕學(xué)者比較了miRNA-21、CA199和CEA診斷胃癌的準(zhǔn)確度，結(jié)果提示三種分子標(biāo)志物診斷胃癌的敏感度和特異度分別為：81.3%、73.4%，60.5%、55.9%，68.6%、59.3%，miRNA-21的準(zhǔn)確度似乎要優(yōu)于傳統(tǒng)的腫瘤標(biāo)記物，提示miRNA-21可能會(huì)成為潛在的診斷胃癌新型分子標(biāo)志物。總之，miRNA-21 在胃癌患者的血漿中表達(dá)顯著上調(diào)，可能與胃癌患者的臨床病理特征指標(biāo)相關(guān)，參與了胃癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，有望成為潛在的腫瘤標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

4 參考文獻(xiàn)

1Torre LA，Bray F，Siegel RL，etal.Global cancer statistics，2012〔J〕.CA Cancer J Clin，2015；65(2)：87-108.

2Esquela-Kerscher A，Slack FJ.Oncomirs-microRNAs with a role in cancer〔J〕.Nat Rev Cancer，2006；6(4)：259-69.

3Zheng Y，Cui L，Sun W，etal.MicroRNA-21 is a new marker of circulating tumor cells in gastric cancer patients〔J〕.Cancer Biomark，2011；10(2)：71-7.

4Gandellini P，Giovannetti E，Nicassio F.MicroRNAs in cancer management：big challenges for small molecules〔J〕.Biomed Res Int，2015；(2015)：982156.

5Zhu S，Si ML，Wu H，etal.MicroRNA-21 targets the tumor suppressor gene tropomyosin 1 (TPM1)〔J〕.J Biol Chem，2007；282(19)：14328-36.

6Shiotani A，Murao T，Kimura Y，etal.Identification of serum miRNAs as novel non-invasive biomarkers for detection of high risk for early gastric cancer〔J〕.Br J Cancer，2013；109(9)：2323-30.

7Zhang Z，Li Z，Gao C，etal.miR-21 plays a pivotal role in gastric cancer pathogenesis and progression〔J〕.Lab Invest，2008；88(12)：1358-66.

8Meng F，Henson R，Wehbe-Janek H，etal.MicroRNA-21 regulates expression of the PTEN tumor suppressor gene in human hepatocellular cancer〔J〕.Gastroenterology，2007；133(2)：647-58.

9Meng F，Henson R，Lang M，etal.Involvement of human micro-RNA in growth and response to chemotherapy in human cholangiocarcinoma cell lines〔J〕.Gastroenterology，2006；130(7)：2113-29.

10Chan JA，Krichevsky AM，Kosik KS.MicroRNA-21 is an antiapoptotic factor in human glioblastoma cells〔J〕.Cancer Res，2005；65(14)：6029-33.

11Li J，Huang H，Sun L，etal.MiR-21 indicates poor prognosis in tongue squamous cell carcinomas as an apoptosis inhibitor〔J〕.Clin Cancer Res，2009；15(12)：3998-4008.

12Gao W，Lu X，Liu L，etal.MiRNA-21：a biomarker predictive for platinum-based adjuvant chemotherapy response in patients with non-small cell lung cancer〔J〕.Cancer Biol Ther，2012；13(5)：330-40.

13Jiang J，Zheng X，Xu X，etal.Prognostic significance of miR-181b and miR-21 in gastric cancer patients treated with S-1/Oxaliplatin or Doxifluridine/Oxaliplatin〔J〕.PLoS One，2011；8(6)：e23271.

14Motoyama K，Inoue H，Mimori K，etal.Clinicopathological and prognostic significance of PDCD4 and microRNA-21 in human gastric cancer〔J〕.Int J Oncol，2010；36(5)：1089-95.

15Wu J，Li G，Wang Z，etal.Circulating MicroRNA-21 is a potential diagnostic biomarker in gastric cancer〔J〕.Dis Markers，2015；(2015)：435656.

16Tsujiura M，Ichikawa D，Komatsu S，etal.Circulating microRNAs in plasma of patients with gastric cancers〔J〕.Br J Cancer，2010；102(7)：1174-9.

17Zeng Z，Wang J，Zhao L，etal.Potential role of microRNA-21 in the diagnosis of gastric cancer：a meta-analysis〔J〕.PLoS One，2013；8(9)：e73278.