益母草堿對窒息新生大鼠心肌損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究＊

張麗娜，吳星恒，王平，梁瑩

(1、南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科，南昌 330006；2、南昌市第五醫(yī)院，南昌 330001；3、江西省兒童醫(yī)院，南昌 330006)

APJ本質(zhì)上屬于蛋白的一種，與血管緊張素Ⅱ型受體之間有密切的關(guān)系并且APJ也能夠與G蛋白聯(lián)合發(fā)生作用，APJ有一種配體，即Apelin，其來源上屬于內(nèi)源性。Apelin/APJ系統(tǒng)在體內(nèi)分布廣泛，在多組織器官尤其是心血管系統(tǒng)和脂肪組織中高度表達(dá)。Apelin具有增加心肌收縮力、降壓、舒張血管、抑制血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大、阻止活性氧簇(ROS)依賴的心肌細(xì)胞肥大等重要的心血管保護(hù)作用[1]。但其在心血管疾病中的表達(dá)研究得出的結(jié)論不一。

益母草堿是從益母草中提煉的具有生物學(xué)作用的一種物質(zhì)，益母草之所以可以保護(hù)心肌，就是因?yàn)橐婺覆輭A的存在，具有抗血小板聚集、降低血液粘稠度、舒張血管、增加血流量等作用。近年來，益母草堿對缺氧缺血損傷心肌的保護(hù)作用已引起研究者們的廣泛關(guān)注。

本課題組應(yīng)用新生鼠建模，并通過對新生鼠的相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行監(jiān)測，確定心肌受損的程度，并同時(shí)對Apelin/APJ蛋白的表達(dá)進(jìn)行分析與評估，探討窒息新生鼠心肌缺氧缺血損傷病理生理機(jī)制是否與內(nèi)源性Apelin/APJ有關(guān)；藥物益母草堿干預(yù)后能否起到心肌保護(hù)作用并探討其機(jī)制。

1　材料與方法

1.1研究對象的分組 選取實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 （新生鼠）共計(jì)72只，并按體重的大小進(jìn)行編號(hào)處理，采取隨機(jī)的方式進(jìn)行分組：共分成3個(gè)大組，即正常組、窒息組、益母草堿組，每組24只，再按照處理時(shí)間點(diǎn)的不同將每個(gè)大組分成3個(gè)亞組，正常組分為30min亞組，60min亞組，120min亞組，每組8只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物；窒息組也分為30min亞組，60min亞組，120min亞組，每組8只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物；同樣益母草組也分成3個(gè)亞組，即30min亞組，60min亞組，120min亞組，每組8只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。

1.2建模的方法 取容量為55ml的密封的完整的磨口瓶，內(nèi)置鈉石灰，質(zhì)量大約5g，將窒息組的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物置于其中，靜待片刻，等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物安靜下來以后再開始實(shí)驗(yàn)。在磨口瓶的瓶口涂上凡士林，并將磨口瓶密封，讓實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處在缺氧的條件下并立即開始計(jì)時(shí)，時(shí)間持續(xù)0.5h，缺氧處理時(shí)間結(jié)束的時(shí)候進(jìn)行復(fù)氧的操作，時(shí)間持續(xù)2h[2]。正常組的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采取相同的操作，但實(shí)驗(yàn)過程中不將磨口瓶封閉，不缺氧；益母草堿藥物組窒息后立即予腹腔注射益母草堿5mg/kg[3]（藥物由天津馬克生物技術(shù)有限公司提供，A0539）。窒息組的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在進(jìn)行缺氧處理以后立即腹腔注射5mg/kg生理鹽水。各組新生鼠分別于模型建立后30min、60min、120min分批取心臟血及心臟標(biāo)本行各項(xiàng)指標(biāo)的檢測（每個(gè)時(shí)間點(diǎn)8只）。

1.3相關(guān)指標(biāo)的測定 將建模成功的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于30min、60min、120min 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)應(yīng)用戊巴比妥麻醉，并進(jìn)行開胸處理，于心臟取血，0.3ml即可，用離心機(jī)分離，取0.1ml血漿，進(jìn)行肌酸激酶和乳酸脫氫酶的測定，應(yīng)用的設(shè)備應(yīng)為通過檢測的全自動(dòng)生化分析儀(Olympus)。

1.4組織的病理學(xué)檢查 將建模成功的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于30min、60min、120min 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)于心尖部取適量的標(biāo)本，經(jīng)沖洗、濾干、以及固定等操作以后，應(yīng)用石蠟進(jìn)行包埋。制作成組織切片，以4-5μm為最佳。然后進(jìn)行蘇木精-伊紅染色，于光鏡下觀察組織的病理學(xué)改變。

1.5ELISA法測定心肌組織Apelin及APJ蛋白表達(dá) 將所取的標(biāo)本于-70℃的條件下保存。在進(jìn)行檢測時(shí)，首先將標(biāo)本放置于醋酸中，并將醋酸的濃度固定于0.1mol/L，不需要太多，2ml即可，加熱至100℃，并持續(xù)大約10min，然后應(yīng)用離心機(jī)進(jìn)行離心，條件為：3000r/min，時(shí)間大約持續(xù)15mim，然后取上層的提取液。應(yīng)用ELISA法進(jìn)行Apelin蛋白含量的測定（計(jì)量單位為濃度ng/L)及APJ蛋白含量(計(jì)量單位為濃度ng/ml），整個(gè)過程中要注意操作的流程一定要規(guī)范，可以參考試劑盒的說明進(jìn)行。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 將所得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)錄入，并應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行對比與分析。計(jì)量資料用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間的分析采用方差分析，組內(nèi)的分析應(yīng)用SNK-q檢驗(yàn)，P<0.05代表差別具備統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞0.05代表差別不具備統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1窒息后新生鼠的一般情況 窒息組及藥物組實(shí)驗(yàn)鼠均表現(xiàn)為懶動(dòng)、少吃。正常組新生鼠因未窒息缺氧，無上述表現(xiàn)。各組均無動(dòng)物死亡。

2.2心肌組織病理學(xué)形態(tài)觀察（見圖1）

圖1　新生鼠心肌組織HE染色結(jié)果（×放大倍數(shù)）

2.3各組新生鼠血清CK濃度變化（見表1）

表1　新生鼠血漿CK濃度比較：（x±s，單位U/L）

2.4各組新生鼠血清LDH濃度變化（見表2）

表2　新生鼠血漿LDH濃度比較：（x±s，單位U/L）

2.5ELISA法檢測心肌組織Apelin的結(jié)果 （見表3）

表3　新生鼠心肌組織Apelin蛋白含量的比較：（x±s，單位ng/L）

2.6ELISA法檢測心肌組織APJ的結(jié)果（見表4）

表4　新生鼠心肌組織APJ蛋白含量值比較：（x±s，單位ng/ml）

3　討論

新生兒窒息是新生兒期危害極大的常見病，可引起新生兒致殘甚至死亡；新生兒窒息多數(shù)是由多因素共同作用的結(jié)果，也可由單一病因引起[4]。窒息后缺氧缺血可導(dǎo)致各臟器損傷，除腦損傷外[5]，其中合并心肌損傷在兒科臨床較為常見[6]，近年來進(jìn)一步探索窒息缺氧所致缺氧缺血性心肌損傷機(jī)制及藥物防治已成為研究熱點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)通過建立新生鼠常壓窒息模型，觀察實(shí)驗(yàn)鼠窒息后一般情況，測定血清CK、LDH等水平變化，并結(jié)合HE染色光鏡下心肌病理形態(tài)學(xué)的改變，通過藥物益母草堿進(jìn)行干預(yù)，從整體水平評估窒息新生鼠心肌損傷情況及藥物的心肌保護(hù)作用。本研究發(fā)現(xiàn)，相比于正常對照組：模型組、藥物組實(shí)驗(yàn)鼠均表現(xiàn)為懶動(dòng)、少吃；血清CK、LDH水平升高，各時(shí)間點(diǎn)均高于正常對照組，且隨著缺氧缺血時(shí)間延長呈上升趨勢。與模型組相比：藥物組血清CK、LDH水平顯著下降，心肌損害程度明顯減輕，證實(shí)了益母草堿對窒息缺氧誘導(dǎo)的在體未成熟心肌損傷具有一定的保護(hù)作用，并進(jìn)一步探討了可能的機(jī)制。

Apelin是近年來發(fā)現(xiàn)的一種生理調(diào)節(jié)肽，目前發(fā)現(xiàn)其主要是由脂肪細(xì)胞分泌，在循環(huán)系統(tǒng)中發(fā)揮主要的作用并具有重要的價(jià)值。目前對于Apelin在心血管疾病中的表達(dá)及作用，所得研究結(jié)論存在分歧。Tycinska等[7]、申健等[8]報(bào)道心梗患者循環(huán)apelin水平降低。與此相反，在缺氧的條件下，新生鼠體內(nèi)的Apelin含量上升、表達(dá)增多，從而推測Apelin可能發(fā)揮代償性作用。與Heo K等[9]臨床觀察基本一致。國內(nèi)張志等[10]通過制備在體和離體心肌缺血模型，證實(shí)在缺血早期，心肌組織Apelin含量代償性增高，長時(shí)間缺血時(shí)表達(dá)下降，此現(xiàn)象說明在發(fā)生心肌缺血尤其是在突發(fā)的條件下，內(nèi)源性Apelin可以保護(hù)機(jī)體不受損傷；Rastaldo和Tempel等通過研究表明，Apelin對心肌局部缺血發(fā)揮保護(hù)作用，是通過促進(jìn)新生血管、限制梗死面積等途徑實(shí)現(xiàn)[11，12]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，窒息新生鼠心肌組織Apelin早期表達(dá)增加，60min達(dá)高峰，120min后表達(dá)較前下降。推測早期心肌缺血，Apelin作為保護(hù)性因子，在心肌缺氧/缺血病理情況下，代償性表達(dá)增加以對抗心肌損害，但隨著時(shí)間推移，可能因代償不足而表達(dá)下降。

Zeng等[13]通過研究發(fā)現(xiàn)，在離體心肌缺血/再灌注大鼠模型中，缺血再灌注可引起APJ受體表達(dá)上調(diào)，外在給予Apelin后可明顯改善缺血/再灌注引起的心肌收縮及舒張功能障礙，可能與心肌組織中APJ受體表達(dá)上調(diào)有關(guān)。此外有研究表明，從某種意義上來說，缺氧可以誘導(dǎo)APJ mRNA和蛋白的表達(dá)，也有助于耐缺氧能力的提升[14]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明心肌組織APJ的表達(dá)與Apelin一致，均呈現(xiàn)早期升高，晚期下降的曲線變化，表明早期心肌細(xì)胞缺氧缺血可以導(dǎo)致APJ的表達(dá)升高。窒息新生鼠心肌缺氧缺血損傷病理生理過程中，內(nèi)源性Apelin/APJ可能發(fā)揮代償性保護(hù)作用。

中藥研究報(bào)道銀杏葉提取物、靈孢花子粉、參附湯抗大鼠心肌缺血損傷的機(jī)制可能與其增加心肌組織Apelin mRNA的表達(dá)，提高Apelin水平有關(guān)[15-17]。但本實(shí)驗(yàn)結(jié)論與之相反，推斷益母草堿可能并非直接通過上調(diào)Apelin/APJ系統(tǒng)蛋白表達(dá)的機(jī)制發(fā)揮對未成熟心肌缺氧缺血性損傷的保護(hù)作用，可能與益母草堿的生物學(xué)作用相關(guān)，也可能是因?yàn)橐婺覆輭A進(jìn)一步抑制了Apelin/APJ蛋白的代償性表達(dá)，從而導(dǎo)致Apelin/APJ蛋白含量下降。但其具體機(jī)制尚不明確，尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。