杞精明目湯含藥血清對結膜松弛癥MAPK信號通路的影響

賈元玲，項敏泓，黃麗，李青松，文杭，詹月萍

結膜松弛癥（conjunctivochalasis,CCh）是年齡相關性眼病，隨著人口老齡化的加劇，患病率逐年上升。患者出現不同程度的角膜炎、瞼板腺炎、干眼及相關的眼表炎癥。Mimura等[1]調查東京醫科大學醫院就診1~94歲共1416例人群中CCh患病率為85.24%。Zhang等[2]對≥60歲社區老年人調查發現CCh患病率為39.01%。Pearson[3]發現在各類眼表疾病中，絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）信號通路對介導炎癥和調控細胞凋亡起著一定的作用。前期研究發現隨著CCh病程的加重，松弛結膜組織中MAPK信號通路中的細胞外信號調節激酶 （extracellular signal-regulated kinases,ERK）、c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase,JNK）及p38 MAPK蛋白表達均有所增強[4]，中藥杞精明目湯治療CCh取得了較好效果[5]。因此本研究旨在進一步通過細胞實驗探討杞精明目湯是否通過MAPK信號通路發揮調控作用，為臨床上應用該方治療CCh提供理論依據。

1　材料和方法

1.1　材料

1.1.1組織標本研究用結膜組織來自于2016年4月—2017年1月在上海中醫藥大學附屬普陀醫院眼科確診為CCh，且符合手術適應癥行新月形松弛結膜切除術的CCh的患者[6]，共7例（7只眼），診斷標準參照文獻[7]。其中Ⅱ級2只眼、Ⅲ級3只眼、Ⅳ級 2 只眼。 年齡 59～82 歲，平均（69.43±8.24）歲。 取材是由同一術者采用相同的方法采集，研究方案已通過上海中醫藥大學附屬普陀醫院倫理委員會批準，并對所有患者進行知情同意。

1.1.2實驗動物雄性SD大鼠30只，普通級（CV），體質量（200±20） g（上海中醫藥大學附屬普陀醫院中心實驗室動物房提供）。

1.1.3藥物杞精明目湯：黃精20 g、麥冬20 g、旱蓮草 15g、枸杞子 15g、茯苓 10g、川芎 3g、炙甘草 3g。根據 “人和動物之間按體表面積折算的等效計量比值”計算出與70 kg成人用藥量相當的200 g大鼠的等效計量，將藥液濃縮為含生藥3.35 g/ml，于4℃冰箱保存備用[8]。

1.1.4主要試劑DMEM培養基、青霉素-鏈霉素溶液（美國Gibco公司）、0.25%胰蛋白酶溶液、牛血清白蛋白（BSA）（美國 Sigma公司）。 Trizol、cDNA 第一條鏈合成試劑盒、熒光定量聚合酶鏈反應試劑盒（日本 Takara公司）；p38 MAPK、JNK、ERK 的酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（美國Abcam公司，貨號 ：ab176664、ab176662、ab176660）；抗 體p38 MAPK、p-p38 MAPK（磷 酸 化 p38 MAPK）、JNK、p-JNK （磷酸化 JNK）、ERK、p-ERK （磷酸化 ERK）、β-actin（美國 CST 公司，貨號：#4695、#4370、#9252、#9251、#8690、#4511、4967S），辣 根 過 氧 化 物 酶（HRP）標記的山羊抗兔IgG二抗、RIPA細胞裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠配置試劑盒、BeyoECL Plus（上海碧云天公司）；引物、熒光探針p38 MAPK、JNK、ERK、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）（上海生工公司）。

1.1.5主要儀器CO2培養箱（日本SANYO公司），超凈工作臺（蘇凈集團安泰公司），倒置顯微鏡（德國WILOVERT公司），低溫高速離心機（德國Eppendorf公司），熒光定量 PCR儀 ABI7300（美國ABI公司），標檢測儀、垂直電泳槽、轉膜儀（美國BIO-RAD公司），化學發光分析系統儀（中國培清公司）。

1.2　實驗方法

1.2.1人結膜成纖維細胞培養切取松弛結膜組織平鋪于6孔板內，將6孔板翻轉為底朝上，然后置于37℃、體積分數5%CO2培養箱中，待組織塊周邊接近干燥（約1~3 min）將6孔板翻轉，于超凈臺中緩慢加入3 ml含體積分數10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養液，勿使組織浮起，繼續培養，每3 d換液1次，倒置顯微鏡下觀察細胞貼壁及培養情況[9]。

1.2.2藥物血清的制備及實驗分組實驗共分3組：分別為CCh+20%含藥血清組 （簡稱含藥血清組）、CCh+20%無藥血清組（簡稱無藥血清組）、CCh對照組。將30只SD大鼠編號，按隨機數字表分為含藥血清組和無藥血清組，每組15只。含藥血清組予杞精明目湯灌胃，無藥血清組予生理鹽水灌胃，均每次2 ml/只，每日2次，連續5 d。最后1次灌胃2 h后 （灌胃前12 h禁食不禁水），2.5%戊巴比妥鈉1.5 ml/kg腹腔麻醉后，消毒，無菌操作下打開腹腔，腹腔動脈采血，靜置2 h，2000 r/min離心25 min，無菌操作下分離出血漿，56℃水浴滅活30 min，0.22 μm過濾器過濾后-20℃下保存備用。臨用前用含1%青-鏈霉素的DMEM培養液配制成20%的含藥或無藥血清。

1.2.3藥物血清干預實驗選擇3～6代80%融合的對數生長期CCh成纖維細胞．將細胞培養基換為無血清培養基繼續培養24 h后，棄去培養基，分別加入20%含藥或無藥血清的細胞全培養基，同時設PBS陰性對照組，繼續培養至4 h分別提取各組的RNA用于反轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription PCR,RT-PCR）檢測，剩余細胞繼續培養48 h提取蛋白質，用于Western Blot實驗。

1.2.4ELISA檢測選取3～6代呈對數生長期細胞，將生長至90%的細胞棄去培養基，用PBS洗2次，并加入試劑盒中的裂解液500 μl裂解細胞，離心后取上清液，置于無菌EP管中，分裝后-80℃冷凍保存，ELISA試劑盒檢測p38 MAPK、p-p38MAPK、JNK、p-JNK、ERK、p-ERK 的相對濃度，酶標儀在 450 nm波長處檢測，測量各孔的光密度D（450 nm），重復3次。

1.2.5Western Blot檢測BCA法檢測蛋白濃度，并調整各組蛋白濃度至同一水平，蛋白變性后進行SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白：蛋白上樣量取20 μg，上層膠5%，下層膠10%，上層膠電壓80 V，下層膠電壓120 V，垂直電泳1.5 h，濕轉膜2 h，電流300 mA，將凝膠上的蛋白轉至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，5%BSA室溫封閉 2 h，4℃孵育一抗過夜，用TBTS洗滌3次，每次10 min。HRP標記的抗兔IgG二抗室溫孵育對應的一抗1h，用TBTS洗滌3次，每次10 min，增強化學發光法（ECL）曝光，化學發光分析系統儀拍照。以β-actin為內參，采用Image J分析軟件對條帶進行半定量分析，計算p38 MAPK、p-p38 MAPK、JNK、p-JNK、ERK、p-ERK 蛋白的相對表達量，重復3次。

1.2.6RT-PCR檢測以oligd（T）18為引物，mRNA模板1 μg，合成cDNA第一鏈；熒光定量PCR按20 μl反應體系進行：10×PCR 緩沖液 10 μl，上游引物 1 μl， 下游引物 1 μl， 熒光探針 1 μl，cDNA 1 μl，PCR級ddH2O 6 μl。樣品和內參均設復孔，引物探針由上海生工生物工程有限公司合成，引物探針序列見表 1。 反應條件為：①95℃1min，95℃30s，60℃30s，共40個循環，ABI7300全自動熒光定量PCR儀。反應結束后，電腦自動分析熒光信號并將其轉換為CT值；②目的基因相對表達水平的計算：直接用樣品的各自內源控制物GAPDH的表達來標準化加入的初始RNA量，即每個樣品的靶基因的相對表達水平△Ct值=靶基因Ct值-GAPDH的Ct值；通過比較不同組的△△Ct值=△Ct1-△Ct2，計算 2-△△Ct值，間接反映各組模板的起始拷貝數之間的倍數關系，重復 3次。

表1　RT-PCR引物序列及產物長度

1.3　統計學方法

應用SPSS 21.0統計學軟件對數據進行統計分析，計量資料以s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1　結膜成纖維細胞生長情況

收集的結膜組織塊，貼壁培養3～6 d后，可觀察到組織塊呈暗色遮光區域，透亮性差，組織周圍有細胞爬出，細胞體積較大，以梭形為主，也可見不規則三角形狀；培養20 d左右可匯合成單層貼壁細胞，利用差速貼壁法，用胰酶消化，待成纖維細胞變圓并部分脫壁時，加入含血清的培養液終止消化，輕輕吹打制成細胞懸液，分瓶接種，2～3代后可得到純度較高的成纖維細胞。處于對數生長期的細胞，緊密連接，排列較為規則，為纖維樣細胞，大小均一，呈放射狀、編織狀排列，細胞核呈卵圓形，細胞間互相交聯。經過倒置顯微鏡對細胞形態觀察，免疫熒光和流式細胞術對培養的CCh結膜成纖維細胞進行特異性蛋白檢測，鑒定為成纖維細胞后用于后續實驗（圖1）。

圖1　倒置顯微鏡下觀察結膜成纖維細胞。1A.原代培養3～6 d后，觀察組織塊呈暗色遮光區域，透亮性差，組織周圍有細胞爬出，細胞體積較大，以梭形為主，也可見不規則三角形狀；1B.為處于對數生長期的細胞，細胞緊密連接，排列較為規則，為纖維樣細胞，大小均一，呈放射狀、編織狀排列，細胞核呈卵圓形，細胞間互相交聯

2.2　ELISA 檢測 p38 MAPK、JNK、ERK（圖 2）

p38 MAPK與p-p38 MAPK：含藥血清組、無藥血清組、CCh對照組的p38 MAPK光密度值分別為2.44±0.33、3.34±0.43、3.92±0.76 （單因素方差分析，F=5.772，P=0.040）；p-p38 MAPK 的光密度值分別為0.11±0.03、0.13±0.02、0.17±0.01（F=6.741，P=0.029）。含藥血清組p38 MAPK、p-p38 MAPK的光密度值明顯低于 CCh 對照組（P=0.015，P=0.011），無藥血清組與CCh對照組的p38 MAPK及p-p38 MAPK差異無統計學意義（P=0.233，P=0.075）。

JNK與p-JNK：含藥血清組、無藥血清組、CCh對照組的 JNK光密度值分別為 1.79±0.09、1.91±0.06、1.96±0.02（F=5.665，P=0.041）；p-JNK 的光密度值分別為 0.23±0.02、0.24±0.02、0.28±0.01（F=9.451，P=0.014）。含藥血清組的JNK、p-JNK光密度值較CCh 對照組明顯降低（P=0.017，P=0.023），無藥血清組JNK光密度值與CCh對照組接近 （P=0.376），p-JNK光密度值低于CCh對照組（P=0.006）。

圖2　ELISA檢測20%杞精明目湯對CCh結膜成纖維細胞p38 MAPK、p-p38 MAPK、JNK、p-JNK、ERK、p-ERK 表達的影響。組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK法，與CCh對照組比較，*P<0.05；與無藥血清組比較，▲P<0.05。　ELISA：酶聯免疫吸附試驗　CCh：結膜松弛癥　MAPK：絲裂原活化蛋白激酶　JNK：c-Jun氨基末端激酶　ERK：細胞外信號調節激酶p-：磷酸化

圖3　Western Blot檢測20%杞精明目湯對CCh結膜成纖維細胞p38 MAPK、p-p38 MAPK、JNK、p-JNK、ERK、p-ERK 蛋 白表達量的影響。組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK法，*P＜0.05 CCh：結膜松弛癥 MAPK：絲裂原活化蛋白激酶JNK：c-Jun氨基末端激酶ERK：細胞外信號調節激酶　p-：磷酸化

ERK與p-ERK：含藥血清組、無藥血清組、CCh對照組的ERK光密度值分別為 2.41±0.03、2.85±0.04、2.94±0.01（F=288.107，P＜0.001）；p-ERK 的光密度值 分別 為 1.44±0.12、1.75±0.09、1.82±0.14 （F=8.519，P=0.018）。含藥血清組ERK與p-ERK光密度值均低于 CCh 對照組（P＜0.001，P=0.008），無藥血清組ERK、p-ERK光密度值與CCh對照組差異均無統計學意義（P=0.051，P=0.511）。

2.3　Western Blot檢測 p38 MAPK、JNK、ERK 蛋白表達（圖3）

p38 MAPK與p-p38 MAPK：含藥血清組、無藥血清組、CCh對照組的p38 MAPK蛋白相對表達量分別為 0.75±0.36、1.21±0.65、1.67±0.72，差異無統計學意義（F=1.756，P=0.251）。 各組 p-p38 MAPK 蛋白相對表達量分別為 1.13±0.14、1.15±0.19、1.75±0.33，含藥血清組、無藥血清組數值明顯低于CCh對照組（P=0.019，P=0.017），且以含藥血清組 p38 MAPK 蛋白磷酸化水平下調更為明顯。

JNK與p-JNK：含藥血清組、無藥血清組、CCh對照組的JNK蛋白相對表達量分別為1.69±0.84、2.12±0.50、2.74±0.59，差異無統計學意義（F=1.953，P=0.222）。三組p-JNK蛋白相對表達量分別為0.98±0.69、1.23±0.84、1.76±1.22， 組間差異亦無統計學意義（F=0.537，P=0.610）。

ERK與p-ERK：含藥血清組、無藥血清組、CCh對照組的ERK蛋白相對表達量分別為1.42±0.60、1.84±0.49、2.19±0.70，組間差異無統計學意義 （F=1.210，P=0.362）。三組p-ERK蛋白相對表達量分別為 0.69±0.14、1.10±0.30、2.46±0.29 （F=39.380，P＜0.001），含藥血清組、無藥血清組數值較CCh對照組明顯降低（P=0.001，P＜0.001），且含藥血清組的 ERK蛋白磷酸化水平下調更為明顯。

2.4　RT-PCR 檢測 p38 MAPK、JNK、ERK mRNA 表達（圖 4）

p38 MAPK mRNA：含藥血清組、無藥血清組、CCh對照組的p38 MAPK mRNA表達量分別為0.19 ±0.12、0.33 ±0.11、1.00 ±0.00（F=62.001，P ＜0.001），含藥血清組、無藥血清組的p38 MAPK mRNA表達量均明顯低于 CCh對照組 （P＜0.001，P＜0.001），可見無藥血清和含藥血清皆可降低CCh的p38 MAPK mRNA的表達，而20%杞精明目湯含藥血清對p38 MAPK mRNA水平下調更為明顯。

JNK mRNA：含藥血清組、無藥血清組、CCh對照組的 JNK mRNA表達量分別為 0.40±0.20、0.44±0.15、1.00±0.00 （F=16.214，P=0.004）， 前兩組 JNK mRNA表達較CCh對照組明顯下降 （P=0.003，P=0.002），其中20%杞精明目湯含藥血清對JNK mRNA水平下調更為明顯。

ERK mRNA：含藥血清組、無藥血清組、CCh對照組的 JNK mRNA表達量分別為 0.22±0.08、0.35±0.12、1.00±0.00 （F=74.035，P＜0.001）， 前兩組 JNK mRNA表達也較CCh對照組明顯下降（P＜0.001，P＜0.001），其中20%杞精明目湯含藥血清對ERK mRNA水平下調更為明顯。

圖4　RT-PCR檢測20%杞精明目湯對CCh結膜成纖維細胞p38 MAPK、JNK、ERK mRNA表達的影響。組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK法，*P＜0.05 RT-PCR：反轉錄聚合酶鏈反應　CCh：結膜松弛癥MAPK：絲裂原活化蛋白激酶　JNK：c-Jun氨基末端激酶ERK：細胞外信號調節激酶

3　討論

CCh是由于球結膜過度松弛和/或下瞼緣張力高，造成松弛球結膜堆積在眼球與下瞼緣、內、外眥部之間形成皺褶，引起眼表淚液學異常，常伴有眼部干澀、異物感、溢淚不適等癥狀的疾病，嚴重者影響視覺和生活質量，但是目前除手術外缺乏有效治療方法[10-11]。故將研究方向轉移到中醫領域，以期在中醫中藥領域尋求更為安全有效的治療方法。

CCh屬于中醫眼科學領域的“白澀癥”范疇，證型多為肝腎陰虛，臨床表現為眼內干澀不爽，雙目頻眨，羞明畏光，白睛隱隱淡紅，久視后諸癥加重。肝開竅于目，肝脈連目系，肝氣通于目，肝和則目能辨五色，淚為肝之液，肝陰不足，目失所養可致眼干澀不舒，治療多以補肝腎，養肝明目為主。我們在經驗方的基礎上研制的杞精明目湯，方中黃精、枸杞子、麥冬滋補肝腎，養陰生津，補益先天精血，共為君藥；茯苓、炙甘草健脾益氣以助生化；陰虛生內熱，旱蓮草補肝腎之陰以清熱涼血；川芎上行頭目，引藥上行。全方滋補肝腎，培補先天之精血；健脾益氣，以助精血之生化。既往研究發現杞精明目湯在維護淚膜穩定性的同時，可改善淚液中的黏蛋白，促進眼表組織損害的修復，改善淚液功能，從而治療CCh[12]。

MAPK是細胞內一類進化上高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，存在于自然界的大多數細胞中。它可以被細胞外的多種刺激因素或信號分子所激活，生理刺激如激素、生長因子、細胞因子等，病理性刺激如缺血再灌注，滲透壓的改變以及炎癥反應等。MAPK家族主要包含細胞外信號調節激酶（ERK），c-Jun 氨基末端激酶 （JNK），p38 MAPK 和ERK5/大絲裂原活化蛋白激酶1（big mitogen-activated protein kinase,BMK1）4條信號通路[13]。 研究證實在干眼等眼表疾病中，前三種信號通路對介導和調控炎癥因子起著一定的作用[14]。在干眼動物模型中，發現早期眼表上皮內即出現ERK、JNK以及p38 MAPK通路的活化，并出現了炎癥介質白介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α） 以及基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）的濃度增高[15]。CCh作為一種特殊類型的干眼，松弛結膜組織存在ERK、JNK及p38 MAPK蛋白表達增強[4]。本研究結果證實20%杞精明目 湯 含 藥 血 清 對 p38 MAPK、p-p38 MAPK、JNK、p-JNK、ERK、p-ERK的蛋白表達和基因轉錄均具有調控作用，尤其是20%杞精明目湯含藥血清能夠顯著抑制p38 MAPK、ERK蛋白的磷酸化水平和p38 MAPK、JNK、ERK mRNA 的表達（P＜0.05），這就進一步從實驗層面證明了杞精明目湯治療CCh的有效性，可能通過干預MAPK信號通路中的關鍵分子從而治療CCh。

對杞精明目湯的中藥成分進行分析發現多味中藥皆有不同程度的抗炎作用且與MAPK信號通路相關：枸杞多糖與炎癥介質和MMPs的表達密切相關[16]，且能顯著抑制紫外線 B（UVB）誘導的p38 MAPK激活，逆轉半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（caspases-3）的活化和MMP-9的表達[17]，通過磷脂酰肌醇-3-激酶/絲氨酸-蘇氨酸激酶（PI3K/Akt）信號通路調節JNK的磷酸化水平[18]。黃精多糖能降低實驗性動脈粥樣硬化家兔血清IL-6及C反應蛋白（CRP）水平[19]，可減輕炎癥反應，提高氧自由基清除能力[20]。麥冬能促進細胞的生長增殖，促進生長因子釋放，抑制炎癥反應[21]，通過抑制TNF-α的水平進一步抑制p38 MAPK的活化[22]。茯苓多糖化合物具有抗炎作用，其作用機制主要是抑制脂多糖誘導的巨噬細胞相關基因的表達，并抑制細胞外信號分子介導的ERK、JNK基因的表達[23]。炙甘草可降低血清MMP-9及MMP-9/TIMP-1（金屬蛋白酶組織抑制劑-1）的表達[24]，并顯著降低血清 TNF-α 的水平[25]。

由于CCh松弛結膜組織中MAPK相關信號通路蛋白表達明顯增強，提示MAPK信號通路參與了CCh的發展過程[4]，且在CCh中熱休克蛋白27（heat shock protein 47,HSP27）表達上調[26]，熱休克蛋白可進一步激活ERK和JNK信號通路使MMP-1和MMP-3的表達增加[27]。MAPK信號通路可以通過激活各種靶細胞的 TNF-β和激活蛋白-1（activator protein-1,AP-1）等轉錄因子調控MMPs的數量和活性[28]。因此我們猜測MAPK通路被磷酸化激活后作用于MMPs等底物，可能導致了CCh的發生與發展。本研究通過細胞實驗證實MAPK通路參與了CCh的發病過程，而20%杞精明目湯含藥血清可以顯著抑制CCh成纖維細胞MAPK信號通路相關蛋白及基因的表達，可能減少MMPs的產生，起到了治療CCh的功效。杞精明目湯含藥血清對MAPK信號通路的干預作用是通過多途徑實現的，包括調節MAPK信號通路相關蛋白的磷酸化水平、抑制炎癥因子表達、減少致纖維化因子表達等。由于本實驗是采用含杞精明目湯全方的藥物血清進行干預研究，含有君臣佐使的各種成分，故不能斷定是藥物相互協同起效，還是某味藥物或其單體的作用，尚需進一步研究明確。