粉碎細度對桑葉粉功能成分溶出的影響

李 玲 丁曉雯 趙 威 張高軍 黃先智

(1. 西南大學生物技術學院，重慶 400715；2. 西南大學食品科學學院，重慶 400715;3. 西南大學蠶學與生物系統研究所，重慶 400715)

桑葉為桑科植物桑(MorusalbaL.)的葉，現代藥理研究[1]證明，桑葉含有黃酮、多酚、多糖、氨基酸、DNJ、膳食纖維等活性物質，有降血糖、降血脂、降血壓、抗氧化、抗菌和抗病毒等多種藥理活性。目前中國的桑葉類保健產品主要是桑葉茶、桑葉咀嚼片、桑葉干粉、桑葉掛面等，不為大眾所熟知[2]，桑葉開發尚有巨大的發展空間。

桑葉的細胞壁結構使桑葉中的活性成分要經過浸潤、溶脹、滲透和擴散等幾個步驟才可以溶出[3]，限制了桑葉有效成分的利用率，將桑葉粉碎是提高其溶出率的有效途徑[4]。超微粉碎是指將物料粉碎至10～25m大小顆粒的新技術，可以加快功能成分溶出效率[5]。研究[6-7]表明，超微粉碎可以顯著降低桑葉粉粒徑，增加蛋白質、多糖與鈣溶解性，但對其他有效成分的研究較少。

本試驗通過研究3種細度桑葉粉的DNJ、黃酮、總酚、多糖、氨基酸和膳食纖維的溶出情況，為其大規模開發利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗原料

桑葉粉：3種細度的勝利大葉桑葉粉，由西南大學家蠶基因組生物學重點實驗室提供。

1.2 試驗試劑與儀器

DNJ標準品、蘆丁標準品、沒食子酸標準品：北京世紀奧科生物技術有限公司；

高效液相色譜儀：LC-20A型，日本島津公司；

全自動凱氏定氮儀：UDK132型，意大利VELP公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 粒徑分布與顯微結構的測定 取0.01 g桑葉粉樣品置于載玻片上，滴1滴稀甘油分散，使用顯微鏡法測量粒徑并觀察纖維特征[8]。

1.3.2 DNJ的測定

(1) 配制1-DNJ標準溶液：0，5，10，15，20，25，30 μg/mL。

(2) 制備待測樣品：每個待測樣本稱取6份，每份0.5 g，分別加入35 mL超純水，80 ℃水浴浸提20，40，60，80，100，120 min(每20 min振搖1次)，使用10～15 μm孔徑的慢速定性濾紙抽濾，濾渣再加15 mL超純水重復提取1次，合并2次濾液用超純水定容至50 mL。DNJ測定方法參考文獻[9]。

1.3.3 黃酮的測定

(1) 配置蘆丁標準溶液：0，50，150，250，350，450 μg/mL。

(2) 制備待測樣品：每個待測樣本稱取6份，每份1.0 g，加入30 mL甲醇，60 ℃水浴條件下分別浸提10，20，30，40，50，60 min，10～15 μm孔徑的慢速定性濾紙抽濾，濾渣再重復提取2次，合并濾液，以甲醇定容至100 mL。黃酮測定方法參考文獻[10]。

1.3.4 總酚的測定

(1) 配置沒食子酸標準溶液：0.00，0.02，0.04，0.06，0.08，0.10，0.12，0.14，0.16 mg/mL。

(2) 制備待測樣品：每個桑葉樣品準確稱取6份，每份1.0 g，加入100 mL純水搖勻，室溫分別浸提0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h，10～15 μm孔徑的慢速定性濾紙抽濾，純水定容至100 mL。總酚測定方法參考文獻[11]。

1.3.5 多糖的測定

(1) 配制葡萄糖標準溶液：1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 μg/mL。

(2) 制備待測樣品：每個樣稱取6份，每份0.25 g，加入25 mL的沸純水，80 ℃水浴提取20，40，60，90，120，180 min，10～15 μm孔徑的慢速定性濾紙抽濾，取濾液用純水定容至25 mL。取1.0 mL濾液于50 mL容量瓶中，用純水定容。多糖測定方法參考文獻[12]。

1.3.6 氨基酸態氮的測定 按GB/T 5009.235—2016執行。

1.3.7 膳食纖維的測定 按GB 5009.88—2014執行。

1.4 數據分析

2 結果與分析

2.1 不同細度桑葉粉的粒徑與顯微形態

2.1.1 粒徑 粉碎可以分為粗粉碎、細粉碎、微粉碎、超微粉碎，其成品粒度分別為5～10 mm、0.1～5.0 mm、<100 μm、10～25 μm[13]。本試驗所用桑葉粉的粒徑分布見表1。

表1 桑葉粉的粒徑Table 1 The particle size of mulberry leaves

根據粒徑分析的結果，細粉、微粉和超微粉的D50%分別為101.00，13.31，8.70 μm，3種桑葉粉分別符合細粉碎、微粉碎和超微粉碎的成品粒度級別，可以將桑葉粉1號歸為細粉、2號歸為微粉，3號歸為超微粉。

與細粉比較，微粉、超微粉的粒徑分別減小58.30%，72.22%；微粉和超微粉的峰度分別增大62.92%，183.71%，峰度增大表示粉碎后粉體粒徑分布更集中。粉碎后微粉與超微粉粒徑的全距分別減小88.74%，93.11%，表示粉碎后粉體粒徑的分布范圍更狹窄，粉體更均勻。

2.1.2 顯微形態 圖1顯示，在顯微鏡下桑葉細粉中可見較大的組織塊，這些組織塊由很多結構完整的細胞組成，表示細粉的粉碎未達到使細胞破碎的程度；微粉中偶見多細胞的組織殘片，少量的細胞碎片散布周圍，達到部分細胞破碎的程度；而超微粉中未見細胞群，只有散落的細胞殘片，沒有完整的細胞結構存在，達到了細胞破碎級別。

圖1 3種桑葉粉的顯微形態Figure 1 Microscopic morphology of three kinds of mulberry leaf (×200)

2.2 不同細度桑葉粉的化學成分溶出量

2.2.1 DNJ溶出量 DNJ是在桑樹中發現的一種生物堿，已被證明可以通過抑制α-葡萄糖苷酶、己糖激酶、葡萄糖醛酸酶和糖原磷酸酶等糖代謝酶，顯著延緩多糖的降解過程[14]，有降血糖、抗病毒和抗腫瘤轉移的作用[15]。測定了3個不同細度桑葉粉的DNJ溶出量，進行了3次重復，結果見圖2與表2。

如圖2所示，在各個提取時間，超微粉和微粉的DNJ溶出量都高于細粉。表2顯示，與桑葉細粉相比，微粉、超微粉的DNJ平均溶出量與最大溶出量均極顯著增大(P<0.01)；與微粉相比，超微粉的最大溶出量顯著增大(P<0.05)，但二者的平均溶出量無顯著性差異(P>0.05)。表明粉碎可以提高桑葉粉的DNJ溶出量。

圖2 不同細度桑葉粉DNJ的溶出量Figure 2 Contents of DNJ in different fineness mulberry leaf表2 不同細度桑葉粉DNJ溶出數據統計?Table 2 The data statistics of DNJ dissolves

分組平均溶出量/(mg·g-1)最大溶出量/(mg·g-1)與提取時間相關系數相關顯著性(P值)細粉 0.90±0.15A1.06±0.01A0.9520.000微粉 2.02±0.73 B2.18±0.03Ba0.5260.025超微粉2.20±0.16B2.28±0.04Bb0.1040.682

? 同列不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

圖2顯示，隨著提取時間的延長，細粉的DNJ溶出呈現先增加后趨于平緩的趨勢，微粉和超微粉的DNJ溶出初始階段增幅比細粉小，提取時間的延長對DNJ溶出影響不大。表2顯示，細粉中的DNJ溶出與提取時間極顯著相關，相關系數為0.952，微粉的DNJ溶出與提取時間極顯著相關，相關系數比細粉小，為0.526，超微粉的DNJ溶出與提取時間沒有顯著性相關關系。表明粉碎可以使桑葉粉的DNJ在較短時間內達到溶出峰值。

2.2.2 黃酮溶出量 黃酮類物質是桑葉的主要活性成分之一，被證明具有明顯的降血脂、降血糖、降血壓、抗氧化作用[16]，對于高脂血癥誘導的糖尿病及心血管系統疾病有一定防治作用[17]。測定了3個不同細度桑葉粉的黃酮溶出量，進行了3次重復，結果見圖3與表3。

圖3顯示，在不同提取時間，桑葉細粉、微粉、超微粉的黃酮溶出量始終呈現出細粉<微粉<超微粉，超微粉的黃酮溶出量始終大約是細粉的2倍。由表3可知，3種細度的桑葉粉的黃酮平均溶出量在各提取時間內的均值均有極顯著性差異(P<0.01)；微粉和超微粉的黃酮最大溶出量都極顯著大于細粉的(P<0.01)，但二者之間無顯著性差異(P>0.05)。表明粉碎可以提高桑葉粉的黃酮溶出量。由圖3可知，隨著提取時間的延長，3種細度桑葉粉的黃酮溶出量均呈現出先增加后趨于平緩的趨勢，提取時間在40 min后，3種桑葉粉的黃酮溶出量穩定在了最大值。微粉的黃酮溶出量在提取時間為30 min內與細粉接近，40 min后與超微粉接近。表3還可以看到，三者的黃酮溶出量與提取時間都極顯著相關(P<0.01)，但細粉的相關系數大于微粉和超微粉的。表明粉碎可以提高桑葉粉中黃酮的溶出效率。

圖3 不同細度桑葉粉的黃酮溶出量Figure 3 Contents of flavone in different fineness mulberry leaf表3 不同細度桑葉粉黃酮溶出數據統計?Table 3 The data statistics of flavone dissolves in different fineness mulberry leaf

分組平均溶出量/(mg·g-1)最大溶出量/(mg·g-1)與提取時間相關系數相關顯著性(P值)細粉 0.53±0.07A0.59±0.03 A0.9240.000微粉 0.63±0.11B0.75±0.02B0.8760.000超微粉0.72±0.07C0.78±0.03B0.8310.000

? 同列不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.2.3 總酚溶出量 桑葉中的多酚類化合物可以清除體內過剩的自由基，防止細胞組織受到氧化傷害，達到抗衰老、抗輻射、防治腫瘤及增加機體免疫力等效果[18]。測定了3個不同細度桑葉粉的總酚溶出量，進行了3次重復，結果見圖4與表4。

圖4 不同細度桑葉粉的總酚溶出量Figure 4 Contents of total phenols in different fineness mulberry leaf表4 不同細度桑葉粉總酚溶出數據統計?Table 4 The data statistics of total phenols dissolves in different fineness mulberry leaf

分組平均溶出量/(mg·g-1)最大溶出量/(mg·g-1)與提取時間相關系數相關顯著性(P值)細粉 7.35±0.16A7.53±0.07a0.7090.001微粉 7.50±0.09B7.57±0.120.1610.523超微粉7.84±0.09C7.80±0.14 b0.0240.923

? 同列不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

由圖4可知，在不同的提取時間下，桑葉粉的總酚溶出始終遵循細粉<微粉<超微粉的規律。表4顯示，3種細度的桑葉粉總酚的平均溶出均有極顯著性差異(P<0.01)；超微粉的總酚最大溶出量顯著高于細粉(P<0.05)的。表明粉碎可以增大桑葉粉中的總酚在各提取時間內的平均溶出量，對其最大溶出量影響較小。

圖4與表4顯示，細粉的總酚溶出量與提取時間極顯著相關(P<0.01)，提取時間越長總酚溶出量越大；而微粉和超微粉的總酚溶出量與提取時間沒有顯著相關關系(P>0.05)，在初始提取時間(0.5 h)即可達到溶出峰值。因此，粉碎可以使桑葉總酚在較短時間達到最大溶出量，提高溶出效率。

2.2.4 多糖溶出量 桑葉多糖具有顯著的調節糖代謝、降血糖和抑制血脂升高的作用[19]，而且具有抗氧化性，對DPPH·和OH·具有顯著清除作用[20]。測定了3個不同細度桑葉粉的多糖溶出量，進行了3次重復，結果見圖5與表5。

圖5 不同細度桑葉粉的多糖溶出量Figure 5 Contents of polysaccharide in different fineness mulberry leaf表5 不同細度桑葉粉多糖溶出數據統計?Table 5 The data statistics of polysaccharide dissolves in different fineness mulberry leaf

分組平均溶出量/(mg·g-1)最大溶出量/(mg·g-1)與提取時間相關系數相關顯著性(P值)細粉 8.55±4.54A16.17±0.53A0.8930.000微粉 15.09±4.19 Ba19.21±0.42 Ba0.9500.000超微粉18.27±3.44 Bb22.08±0.94 Bb0.9390.000

? 同列不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

圖5顯示，粒度越小，桑葉粉中的多糖溶出量越多，呈現細粉<微粉<超微粉的規律。從表5中可以看到，微粉和超微粉的多糖平均溶出量與最大溶出量均極顯著大于細粉(P<0.01)，超微粉的多糖平均溶出量與最大溶出量均顯著大于微粉(P<0.05)。表明粉碎可以提高桑葉粉中多糖的溶出量。

隨著提取時間的延長，各細度桑葉粉的多糖溶出量均有不同程度上升，細粉的多糖溶出量在提取時間終點180 min時趨于平衡，而微粉、超微粉分別在90，60 min時趨于平衡，因此達到平衡所需要的時間細粉>微粉>超微粉，顯示粉碎可以加快多糖溶出速率。

DNJ、黃酮、總酚、多糖的溶出量經過粉體提高的原因可能是：① 小顆粒與溶劑的接觸面積較大，在相同的時間內可以溶出更多的有效成分；② 桑葉粉中的有效成分在溶出的過程中，首先需要吸水溶脹，然后通過簡單擴散的方式逐步擴散到濃度較低的外層細胞，若顆粒較大，則其中的有效成分需要經過幾十層的“障礙”才可以溶出至溶劑，簡單擴散的速度依賴于各級細胞間的濃度差，達到溶出最大值時簡單擴散不再發生，溶劑與各級細胞間濃度差消失，細胞內的有效成分濃度等于溶劑內的有效成分濃度，過濾后，濾渣中殘留的有效成分會損失。超微粉碎使細胞破碎，這些破碎的細胞沒有胞內濃度差，在溶出終點過濾的時候不會截留有效成分。因此增大了DNJ、黃酮、總酚、多糖的最大溶出量。

2.2.5 氨基酸態氮溶出量 桑葉中含有豐富的氨基酸，干物質中的含量約為21%～27%[21]。測定了3個不同細度桑葉粉的氨基酸態氮溶出量，進行了3次重復，結果見表6。

表6 不同細度桑葉粉的氨基酸態氮溶出量?Table 6 Contents of amino acid nitrogen in different fineness mulberry leaf

? 同列不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

由表6可知，3種細度桑葉粉的氨基酸態氮溶出均有極顯著性差異(P<0.01)，粉碎提高了桑葉粉的氨基酸態氮溶出量。桑葉中大部分的氨基酸以蛋白質大分子的形式存在，游離的氨基酸比較少，經過粉碎后部分大分子的蛋白質結構遭到破壞，釋放出了游離氨基酸，有利于動物對于氨基酸的吸收。

2.2.6 膳食纖維含量 測定了3個不同細度桑葉粉的膳食纖維含量，進行了3次重復，結果見表7。

表7 不同細度桑葉粉的膳食纖維含量?Table 7 Dietary fiber content of different fineness mulberry leaf powder g/100 g

? 同列不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

表7顯示，隨著桑葉粉細度的減小，總膳食纖維(DF)，可溶性膳食纖維(SDF)含量增大，不溶性膳食纖維(IDF)含量減小，三者均具有極顯著性差異(P<0.01)。顯示粉碎可以增加膳食纖維與可溶性膳食纖維含量，減少不溶性膳食纖維含量。

原因可能是不溶的大分子IDF結構在粉碎過程中遭到破壞，轉變為可溶的小分子SDF，因此IDF含量減少，而SDF含量增大；還可能是粉碎破壞了植物細胞結構，使得SDF更容易在膳食纖維測定中的酶解過程解離出來，造成SDF含量增加。

3 結論

粉碎可以使桑葉粉中DNJ、黃酮、總酚、多糖的溶出量顯著增大(P<0.05)，氨基酸態氮、可溶性膳食纖維、總膳食纖維含量顯著增大(P<0.05)，不溶性膳食纖維含量減小(P<0.05)。綜上，粉碎有利于桑葉粉的有效成分溶出，提高桑葉粉利用率。但是，本研究中不同成分溶出情況是在該成分的最佳提取試劑中測定的，在人體胃腸道中溶出的情況還需要進一步探討。