食鹽對混合菌種發酵香腸質量指標的影響

李 佳 劉忠義 陳 虞 羅鑫坪 楊 慧 李 平

(1. 廣西高校北部灣特色海產品資源開發與高值化利用重點實驗室﹝欽州學院﹞，廣西 欽州 535000； 2. 湘潭大學化工學院，湖南 湘潭 411105)

發酵香腸歷史悠久，2 000多年前地中海地區的古羅馬人便用碎肉加鹽、糖、香辛料等經過自然發酵、風干成滋香味美的香腸[1-2]，如今，發酵香腸已發展成為發酵肉制品中產量最大的一類產品。在發酵過程中，乳酸菌發酵使可發酵性糖形成乳酸，降低產品的pH值。較低的pH值使得肉中的鹽溶性蛋白質變性，形成具有切片性的凝膠結構。添加食鹽和干燥過程可以降低肉制品的水分活度，益生菌發酵產生的厭氧環境，與低pH值共同作用，保證了產品的穩定性和安全性[3]。

現代發酵香腸的加工傾向于使用純培養的乳酸菌等發酵菌種，可以使生產過程的微生物安全性及產品質量更有保障，且乳酸菌發酵的食品更有益于人體健康[4-7]。研究[8]表明，在肉制品和魚制品的發酵過程中，接種純培養的乳酸菌等益生菌可以降低制品的pH值，抑制腐敗微生物和大腸桿菌等的生長繁殖，降低發酵肉、魚制品中的揮發性鹽基氮含量，抑制生物胺的生成和積累，改善魚制品的色澤和白度，改善肉、魚制品的風味。另有研究[9-11]指出，在蔬菜的發酵與腌制加工中，乳酸菌等益生菌可以降低亞硝酸鹽含量。

發酵肉腸的工藝條件的研究主要集中在發酵劑用量及配比，發酵溫度、發酵濕度、發酵時間等方面[2]，而關于發酵過程中鹽濃度的作用和影響的研究較少。目前大多數發酵香腸中添加的食鹽量為3%～8%[12-13]。鹽濃度對益生菌及腐敗菌具有重要的影響，此外食鹽攝入量過多會造成心腦血管疾病，特別是加大誘發高血壓的風險[14]，低鹽食品有益于人體健康。因此，非常有必要探究能否在添加更低濃度食鹽(≤3%)的條件下生產出優質且食用安全有保障的發酵肉制品。

在前期的研究中，依據文獻[2]，并通過實驗驗證了在發酵溫度32 ℃、發酵時間6～9 h的基礎上，添加0.08%乳酸菌和0.04%酵母進行混合發酵可以得到風味品質俱佳的發酵香腸。本試驗擬探討在合適的發酵溫度和時間段，低鹽濃度范圍內不同鹽濃度對理化安全指標和微生物安全的影響，期望為發酵香腸改良生產工藝提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

新鮮豬肉：購于湘潭某集市；

乳酸菌發酵劑：3.12×109CFU/g，北京川秀科技有限公司；

酵母發酵劑：3.95×109CFU/g，安琪酵母股份有限公司；

腸衣：譚氏百盛電子商務有限公司;

1-7二氨基庚烷、丹酰氯：分析純，德國AppliChen公司；

亞硝酸鈉、亞鐵氰化鉀、硼砂、乙酸鋅、對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、氧化鎂、硼酸、鹽酸、甲基紅-乙醇指示劑、次甲基藍指示劑：分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司；

MRS培養基、PCA培養基、孟加拉紅培養基、VRBA、BGLB肉湯：生化試劑，上海盛思生化科技有限公司。

1.1.2 主要儀器設備

電子分析天平：PTX-FA-110型，上海精密科學儀器有限公司；

數顯酸度計：PHS-3BW型，上海雷磁儀器廠；

紫外分光光度計：Cary60型，安捷倫科技有限公司；

恒溫水浴鍋：HH-4型，上海申生科技有限公司；

半微量定氮器：1765型，上海昕滬實驗設備有限公司；

電熱鼓風干燥箱：FN 101-2型，長沙儀器儀表廠；

手提式滅菌鍋：YXQ-SG46-280S型，上海醫用儀器有限公司；

垂直流潔凈工作臺：SCW-CJ-1F型，蘇州市長春電子儀器廠；

恒溫培養箱：SPX-250B-D型，上海躍進醫療器械廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 豬肉的腌制與發酵 取新鮮豬肥、瘦肉清洗干凈后，分別絞碎成肉糜；腌制劑：2.0%(g/100 g·肉糜，所有配料均如此)食鹽、0.2%味精、0.3%胡椒粉、0.2%姜粉、0.2%五香粉、2.4%白糖、0.1%紅曲粉、0.1%磷酸鹽、0.8%醬油、2.4%黃酒；瘦肉糜中加入準備好的腌制劑在2 ℃冷藏柜腌制18 h，然后肥、瘦肉糜按3∶5 的質量比混合，加入0.08%的乳酸菌和0.04%的酵母后灌腸，將其置于(32±1) ℃、相對濕度75%～80%條件下發酵9 h。

1.2.2 指標分析 在瘦肉糜中添加不同量食鹽，經過18 h低溫腌制后，添加混合菌種發酵9 h，以四分法取樣，分別對新鮮豬肉以及發酵0，6，9 h的肉腸進行pH、亞硝酸鹽、TVB-N 以及微生物生長情況的測定，以探究鹽濃度對香腸安全性指標的影響。

(1) pH值的測定：取5 g樣品加入20 mL去離子水(pH 7.0)勻漿后震蕩30 min，再用數顯酸度計測定pH值[15]。

(2) 亞硝酸鹽的測定：按GB 5009.33—2010《食品安全國家標準 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》的方法二執行。

(3) 揮發性鹽基氮：按GB/T 5009.44—2003《肉與肉制品衛生標準的分析方法 半微量定氮法》執行。

(4) 微生物學指標測定：以無菌方式取破碎樣品25.0 g，以10倍系列稀釋法對樣品進行稀釋，選取2～3個適宜的稀釋度傾注或涂布平板。乳酸菌：用MRS培養基涂布平板，于(36±1) ℃培養(48±2) h后計數；菌落總數：用PCA培養基傾注平板，于(36±1) ℃培養(48±2) h后計數；大腸菌群：用VRBA傾倒雙層平板，于(36±1) ℃培養(24±1) h后計數；典型和可疑菌落，用BGLB肉湯做驗證實驗后計數。

1.3 數據處理

所有試驗重復3次。用SPSS statistix 16.0統計分析軟件進行均值計算及方差分析，數值以均值±標準差表示，P<0.05即表示差異顯著。作圖采用Origin 8.5。

2 結果與討論

2.1 發酵過程中微生物變化

如表1所示，在不同鹽濃度腌制條件下，發酵初始乳酸菌數隨鹽濃度升高而略微減少但差異不顯著(P>0.05)。發酵6 h后，鹽濃度從低到高乳酸菌數分別增長到(6.07±0.12)，(5.81±0.08)，(5.72±0.15)，(5.63±0.02) lg CFU/g。繼續發酵至9 h后，不同鹽濃度下乳酸菌數繼續增加，增長速度和發酵6 h后保持一致，低鹽濃度時乳酸菌數增長速度較快，隨著鹽濃度的增加，乳酸菌數增長速度降低。4組中乳酸菌數在鹽濃度1.5%條件下增長最快，當鹽濃度高于2.5% 時，乳酸菌的增長數量發生明顯變化，說明2.5%以上的鹽濃度開始對乳酸菌的生長繁殖產生鹽脅迫作用，抑制了乳酸菌的生長繁殖，同時影響乳酸菌的存活率[16]。

由表2可知，在發酵初始1.5%鹽濃度腌制條件下大腸菌群數明顯高于其他組，且具有顯著性差異(P<0.05)。發酵6，9 h后，不同鹽濃度下大腸菌群存在顯著的差異。1.5% 鹽濃度下發酵6，9 h后大腸菌群增幅最大，隨著鹽濃度的增加，大腸菌群數量增幅減少。試驗結果顯示，肉腸的鹽濃度越高，對大腸菌群抑制性越強。其次，也有研究指出，乳酸菌發酵可以抑制大腸菌群的增值速度[17-18]，且大腸菌群與腌制、發酵香腸生物胺的生成和積累密切相關，抑制大腸菌群的生長繁殖可以顯著降低香腸中生物胺含量[15,18]。腸道菌還與腌制發酵蔬菜中的亞硝酸鹽含量相關，一般抑制腸道菌的生長繁殖有利于降低腌制發酵蔬菜中的亞硝酸鹽含量[9-11]。

如表3所示，腌制結束后3.0%鹽濃度腌制條件下菌落總數明顯低于其他組。發酵6，9 h時，不同鹽濃度發酵條件下菌落總數表現出顯著的差異性(P<0.05)，其規律均是隨著鹽濃度的升高而菌落總數相對變少。鹽濃度為1.5%時，菌落總數增長幅度最大，當鹽濃度增大到3.0%時，9 h時較6 h時菌落總數略有升高但差異不大，說明3.0%鹽濃度能抑制益生菌發酵香腸中絕大部分微生物的生長，與后面的pH值、亞硝酸鹽含量以及TVB-N的試驗結果可以相互印證。

從上面3種微生物的生長變化情況來看，鹽濃度對乳酸菌、大腸菌群、菌落總數均有負效應，即隨著鹽濃度的增加，微生物數量相應地下降，其中鹽濃度對菌落總數的影響最強，可能是香腸中大部分微生物的食鹽敏感性，導致隨著鹽濃度的增加，菌落總數明顯出現下降，并且腐敗菌及有害微生物的生長也受到了抑制，有益于產品的品質，這也是用食鹽腌制食物延長保藏期的原理。

2.2 發酵過程中pH變化

由圖1可知，腌制結束后，各組的pH基本上同等降低，各組之間無顯著性差異。不同鹽濃度條件下發酵6 h后，各組pH值均呈下降趨勢，其pH值在5.61～5.89，繼續發酵至9 h后pH值進一步降低，其pH值降低至5.51～5.79。發酵時間相同時，鹽濃度越低，pH值下降幅度越大。這表明鹽濃度顯著影響了發酵香腸pH值的下降速度。鹽濃度影響肉腸中微生物的滲透壓，當鹽濃度為3.0%時，pH值下降幅度小，說明乳酸菌的生長繁殖可能受到了抑制。這個結果和前面乳酸菌及其他微生物的試驗結果可以相互印證。一般情況下，發酵香腸的pH值都會下降[7,19]，pH值的降低有利于香腸中亞硝酸鹽的降低、發酵風味的形成及保藏。

表1 鹽濃度對香腸乳酸菌數的影響?Table 1 Effect ofsalt concentration on lactic acid bacteria of sausage lg CFU/g

? 同列字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

表2 鹽濃度對香腸大腸菌群數的影響?Table 2 Effect of salt concentration on the number of coliform bacteria in sausage lg CFU/g

? 同列字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

表3 鹽濃度對香腸菌落總數的影響?Table 3 Effect ofsalt concentration on the number of bacterial colonies in sausage lg CFU/g

? 同列字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

圖1 鹽濃度對香腸pH的影響Figure 1 Effect of salt concentration on pH of sausage

2.3 發酵過程中亞硝酸鹽、TVB-N變化

從圖2可知，在原料中添加食鹽進行18 h低溫腌制后，1.5% 及2.0%鹽濃度腌制條件下殘留的亞硝酸鹽量與其他組具有顯著性差異(P<0.05)，并且亞硝酸鹽的殘留量隨著鹽濃度的增大而增加。而香腸發酵6，9 h后，亞硝酸鹽殘留量與鹽濃度呈現正相關，較低鹽濃度發酵條件下亞硝酸鹽的累積量始終低于較高鹽濃度的，說明在發酵過程中較高鹽濃度發酵條件會累積更多的亞硝酸鹽。文獻[20]指出高食鹽含量肉制品中蛋白質易與亞硝酸鹽反應，因此使殘留的亞硝酸鹽濃度下降。本試驗也得出一致結論，在不同鹽濃度腌制條件下，原料中的亞硝酸殘留量隨鹽度的增加而降低。而當肉腸進入發酵后，在乳酸菌的作用下，較高鹽濃度抑制了乳酸菌的生長，從而可能影響乳酸菌對亞硝酸鹽的降解。文獻[20]還指出亞硝酸鹽殘留量隨著香腸pH值的降低而減少，與本試驗的結果一致。此外，在一些關于酸菜發酵的文獻[11,21-22]記載，乳酸菌有降低亞硝酸鹽積累的作用。

圖2 鹽濃度對香腸亞硝酸鹽含量的影響Figure 2 Effect of salt concentration on nitrite content of sausage

從表4中可以看出，在原料中添加食鹽低溫腌制18 h后，雖然數據分析顯示不同鹽濃度條件下TVB-N的含量具有顯著差別，但是實際數值差異甚微。由于TVB-N主要來源于蛋白質的分解或者腐敗[23]，因此在低溫腌制18 h的情況下，鹽濃度對蛋白質的腐敗影響較小，可能是低溫抑制了腐敗菌的生長繁殖及代謝。發酵到6 h時，不同鹽濃度肉腸中的TVB-N含量增長幅度隨著鹽濃度的增加而減少，較低鹽濃度增長速度更快，而從6 h發酵到9 h后，1.5%鹽濃度發酵條件下T-VBN含量繼續升高，而其他鹽濃度發酵條件下TVB-N含量卻略有降低，其含量分別降至(2.73±0.05)，(2.70±0.02)，(2.69±0.01) mg/100 g。TVB-N主要是由于酶和細菌的作用使蛋白質分解而產生氨以及胺類等堿性含氮物質，說明2.0%的鹽濃度就可能對腐敗微生物或蛋白酶活性有一定的抑制作用。此外，也有研究[18,24]指出由于胺類能進入細胞內與糖代謝產生的有機酸反應生成氨基酸，而使得TVB-N含量下降。

和前面微生物的試驗結果相互印證，推測抑制腐敗菌和大腸菌群的生長繁殖，可以降低發酵香腸中亞硝酸鹽及TVB-N的生成和積累。

表4 鹽濃度對香腸揮發性鹽基氮含量的影響?Table 4 Effect ofsalt concentration on TVB-N Content of Sausage mg/100 g

? 同列字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

3 結論

研究了在1.5%～3.0%的鹽濃度條件下低溫腌制及接種人工菌種的發酵過程中香腸部分理化指標的變化以及微生物生長情況，發現低鹽濃度亞硝酸鹽累積速度較慢，而高鹽濃度TVB-N含量累計速度更慢，雖然食鹽的添加能有效抑制細菌的生長，但濃度過高可能導致過咸以及延遲成熟，影響肉腸的口感與品質；另外對發酵肉腸而言，pH值過低，則會使產品酸度過高，在口感上讓人難以接受，而pH值過高，會使產品無法顯現出發酵肉制品特有的香味[25]，因此，考慮到發酵肉腸的安全性以及食鹽作為調味品對風味的影響，鹽濃度選擇2.0%～2.5%較為適宜。同時，綜合考慮亞硝酸鹽含量和微生物菌落數的變化，發酵時間以6 h較為合適。

食鹽的濃度同樣影響香腸發酵過程中蛋白質的變化、香腸的凝膠特性和質構以及發酵香腸的風味，因此這也是后期試驗亟待研究的問題。