太空茄子葉黃酮大孔樹脂純化工藝優化及抗氧化性研究

楊 彬 金小青 李彩霞 焦 揚

(1. 河西學院農業與生物技術學院，甘肅 張掖 734000;2. 甘肅省高校河西走廊特色資源利用省級重點實驗室，甘肅 張掖 734000)

茄子(FructussolanμmmelongenaL.)為茄科茄屬以漿果為產品的一年生草本植物。原產地印度，在中國已有1 500 多年的栽培歷史[1]。太空茄作為其品種之一，產量高、品質好、營養豐富。茄葉作為茄子生產中的下腳料，資源豐富，目前主要被作為飼料或肥料使用，附加值較低。對茄子葉黃酮分離純化的研究相對較少，僅見莫天錄等[2]采用大孔吸附樹脂對綠茄葉中黃酮的純化研究，未見有關太空茄葉的研究報道。

黃酮類化合物是指以色原酮為母核的一大類有機化合物，是植物重要的次級代謝產物，廣泛存在于植物的各個器官[3]。研究發現黃酮類化合物具有抗氧化、抗炎[4]、保肝、防止心血管疾病、抗過敏、抗突變[5]、皮膚抗衰老美容等多種生理功能[6]，因而黃酮被稱為“第七類營養素”。目前眾多學者從天然植物中提取黃酮等活性成分，然而茄子各部位含有許多活性成分[7]，其果實是重要的蔬菜。茄子果實采摘后，用茄子葉提取黃酮并進行分離純化，補充活性成分資源不足，變廢為寶。

大孔樹脂是近年發展起來的一類具有多孔立體結構的有機高分子聚合物吸附劑，具有吸附容量大、選擇性好、容易解吸、機械強度大、可重復使用等特點[8]，已廣泛應用于多酚、生物堿、二氫槲皮素、皂苷等活性成分的分離純化[9-10]。本試驗擬通過對5種不同類型大孔樹脂的吸附和解吸性能進行比較，篩選適宜的純化太空茄葉黃酮的大孔樹脂，對其靜態吸附、解吸及動態純化效果進行分析，并測定純化前后黃酮提取物含量及抗氧化活性，以期為太空茄子葉黃酮深度開發和利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

太空茄子葉片： 河西學院農學試驗園采摘；

蘆丁標準品：中國藥品生物制品鑒定所；

無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁，氫氧化鈉等：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

D101、D4020、X-5、AB-8、NAK-Ⅱ樹脂：物理屬性見表1，天津南開大學化工廠；

雙配套循環水式多用真空泵：SHZ-2000型，河南省鞏義市英峪予華儀器廠；

分光光度計：Spectrμmlab24型，上海棱光技術有限公司；

表1 吸附樹脂的物理性質Table 1 Physical properties of the adsorption resin

數顯恒溫水浴鍋：HH-4型，國華電器有限公司；

電子天平：FA2104型， 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；

層析柱：Φ15 mm×30 mm，上海亞榮生化儀器廠；

旋轉蒸發器：RG-2000A型，鞏義市京華儀器有限責任公司；

恒溫振蕩培養箱：HZP-250型，上海精宏實驗設備有限公司；

自動核酸蛋白分離層析儀：MC99-2型，上海青浦滬西儀器廠；

冷凍干燥機：Scientz-100F型，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 黃酮的提取與測定

1.2.1 太空茄葉預處理 太空茄子葉片清洗、陰干、粉碎、過250 μm篩，按照1∶5 (g/mL)比例加入石油醚回流2.5 h，除去葉片中的色素、揮發油等物質后風干備用。

1.2.2 太空茄葉黃酮粗提取的制備 準確稱取預處理的50 g 太空茄子葉粉末，按照1∶42 (g/mL)比例加入78%的乙醇，80 ℃回流提取1.8 h，冷卻后真空抽濾，收集上清液，減壓濃縮回收乙醇，冷凍干燥后得太空茄葉黃酮浸膏；稱取2.5 g 黃酮浸膏，用去離子水溶解，移至250 mL容量瓶并定容，得到質量濃度1.79 mg/mL的黃酮溶液，冷藏備用。

1.2.3 太空茄子葉黃酮含量的測定 參照文獻[11]，根據式(1)計算黃酮含量。

(1)

式中：

Y——黃酮含量，%；

C——標準曲線上查得黃酮質量，μg；

V——黃酮提取液總體積，mL；

N——樣品的稀釋倍數；

M——樣品的重量，g；

VS——測定時所取溶液的體積，mL。

1.3 最佳樹脂篩選

1.3.1 樹脂預處理 試驗選用的5種樹脂分別用無水乙醇浸泡24 h后過濾，采用去離子水沖洗至無乙醇味；吸干樹脂表面水分后用5% HCl浸泡3 h；去離子水沖洗至中性，用2% NaOH浸泡3 h，去離子水洗至中性，吸干樹脂水分后備用[12-13]。

1.3.2 樹脂吸附率和解吸率測定 取5種預處理后大孔樹脂各2.0 g，置于100 mL三角瓶中，分別加入一定濃度的黃酮溶液15 mL，在25 ℃、150 r/min恒溫振蕩24 h 后過濾，測定濾液中黃酮含量；在吸附飽和的樹脂中加入15 mL 體積分數為78%的乙醇溶液，振蕩解吸24 h后過濾，測濾液中黃酮含量，按式(2)～(4)計算吸附率、解吸率及吸附量[14]。

(2)

(3)

(4)

式中：

α——吸附率，%；

β——解吸率，%；

T——吸附量，mg/g；

C0——初始樣液黃酮質量濃度，mg/mL；

V0——初始樣液體積，mL；

C1——吸附平衡后黃酮質量濃度，mg/mL；

C2——解吸液中黃酮質量濃度，mg/mL；

M——預處理后樹脂質量，g。

1.3.3 靜態吸附 取2.0 g預處理樹脂NAK-Ⅱ，放置在50 mL 三角瓶中，以吸附時間、黃酮質量濃度、樣液pH為單變量，加15 mL黃酮提取液，在25 ℃、150 r/min的條件下振蕩吸附飽和后，按前述方法測黃酮含量，計算吸附率。分別以吸附率對時間、濃度、pH作圖并繪制靜態吸附曲線。

1.3.4 靜態解吸 取2.0 g預處理樹脂NAK-Ⅱ，以解吸時間、解吸劑體積分數、解吸劑pH值為單變量，加15 mL乙醇解吸液，25 ℃、150 r/min條件下振蕩解吸，按前述方法測定解吸液黃酮含量，計算解吸率。分別以解吸時間、解吸劑體積分數、解吸劑pH值作圖并繪制靜態解吸曲線。

1.3.5 太空茄子葉黃酮的NKA-II樹脂柱層析 預處理的NKA-II樹脂，濕法裝柱(層析柱15 mm×140 mm)，用5倍柱床體積(BV)的蒸餾水除雜后，取質量濃度為362.6 μg/mL的粗黃酮，以1.7 BV/h的流速對黃酮上柱純化。再用12 BV的蒸餾水除雜后以8 BV、70%的乙醇解吸，每3 min收集2.1 mL，每管取0.3 mL測定黃酮含量。

1.3.6 NKA-II樹脂對太空茄子葉黃酮的純化效果 分別稱取0.1 g粗黃酮和經純化后的黃酮，用78%的乙醇溶解后定容至50 mL，各取0.4 mL測定黃酮含量，并計算純化黃酮倍數。

1.3.7 純化前后太空茄子葉黃酮抗氧化活性

(1) 對DPPH·清除力：根據文[15～16]修改如下，吸取質量濃度為33.6，16.8，13.4，6.7，4.5，3.4，2.7 μg/mL的純化前后黃酮液2.00 mL，分別加入0.15 mmol/L DPPH溶液2 mL，混合均勻后常溫避光反應30 min，在517 nm下測定吸光值Ai，并以2.00 mL黃酮液和2.00 mL 95%乙醇為樣品空白組，以相同質量濃度的蘆丁為陽性對照。按式(5)計算清除率。

(5)

式中：

CR——清除率，%；

A0——未加黃酮液樣品的吸光度；

Aj——相應質量濃度黃酮液的本底吸光度；

Ai——樣品組吸光值。

(2) 對ABTS+·清除力：根據文獻[17]。按式(5)計算ABTS+·清除率。

1.4 數據統計與處理

采用Excel 2003進行數據處理，使用SPSS 16.0軟件統計分析，不同樹脂之間的顯著性差異采用新Duncan復極法進行比較。試驗重復3次。

2 結果分析

2.1 最佳樹脂類型的篩選

如表2所示，D101與D4020差異不顯著，但NAK-Ⅱ與其他樹脂差異顯著；從解吸率看，NAK-Ⅱ與D4020差異不顯著，NAK-Ⅱ與其他樹脂差異顯著。X-5的解吸率較高，但其吸附率最低；NAK-Ⅱ吸附率和解吸率均最高。綜合吸附率、解吸率和吸附容量3個參數，得出NAK-Ⅱ類型樹脂是較好的吸附樹脂，以下試驗用NAK-Ⅱ大孔樹脂對太空茄子葉黃酮進行純化。

2.2 靜態吸附試驗

2.2.1 吸附時間對NAK-Ⅱ樹脂吸附率的影響 從圖1中

表2 5種樹脂對太空茄子葉黃酮吸附率與解吸率的影響?

Table 2 Effects of 5 macroporous resins on absorption and desorption rates of flavonoids from eggplant leaves

樹脂型號總黃酮吸附容量/(mg·g-1)總黃酮吸附率/%總黃酮解吸率/%D10111.2083.44b68.23dcD402011.2483.75b71.00abX-59.7972.92d70.88abAB-810.6079.00c64.24dNKA-II12.9796.64a71.29a

? 同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

圖1 吸附時間對太空茄葉黃酮吸附率的影響Figure 1 Effects of absorption time on adsorption rates of flavonoids from eggplant leaves

可看出，吸附時間在0.5～1.0 h時吸附率增長迅速，1.0 ～2.5 h 時吸附速率較快，2.5 h后達到平衡，之后隨著時間繼續延長，吸附率變化趨于平緩。因此，確定吸附時間為2.5 h。

2.2.2 樣品質量濃度對NAK-Ⅱ樹脂吸附的影響 由圖2可知，太空茄子葉黃酮的吸附率隨其質量濃度的升高呈先上升后下降趨勢，當黃酮質量濃度為0.362 6 mg/mL時吸附率達最大值(98.257 4%)；繼續增大黃酮質量濃度，吸附率開始降低。可能是黃酮濃度越高，其結構中含有酚羥基、羰基官能團容易構成氫鍵而聚合成大分子，不易被吸附。因此，黃酮粗提液最佳質量濃度為0.362 6 mg/mL。

2.2.3 黃酮粗提取液pH對NAK-Ⅱ樹脂吸附的影響 從圖3可以看出，太空茄子葉黃酮的吸附率隨其粗提液pH值的升高呈下降趨勢，當pH值為2時黃酮的吸附率最高(97.49%)。原因可能是pH值較小時，弱酸性黃酮類物質呈現為分子形式，通過范德華力相互作用被吸附；當pH值過高時，黃酮類分子中酚羥基H+容易失去，形成離子結構，不易被樹脂吸附。因此，適宜的黃酮粗提液pH值為2。

圖2 樣品濃度對太空茄葉黃酮吸附率的影響

Figure 2 Effects of sample concentrations on absorption rates of flavonoids from eggplant leaves

圖3 樣液pH對太空茄葉黃酮吸附率的影響Figure 3 Effects of sample pH on absorption rates of flavonoids from eggplant leaves

2.3 靜態解吸試驗

2.3.1 太空茄子葉黃酮在NAK-Ⅱ樹脂上的解吸曲線 由圖4可以看出，解吸時間在前10 min內，解吸率隨時間的延長增長較快；10 min后，吸附率增長較緩慢；當解吸時間到40 min時，解吸基本趨于平衡。因此，確定解吸時間為40 min。

圖4 解吸時間對太空茄子葉黃酮解吸率的影響Figure 4 Effects of time on desorption rates of flavonoids from eggplant leaves

2.3.2 乙醇濃度對NAK-Ⅱ樹脂解吸效果的影響 黃酮類化合物大部分為極性且其范圍較廣泛。依據“相似相容”原理，不同極性的黃酮類化合物能溶于不同體積分數的乙醇。從圖5可以看出，隨乙醇體積分數的升高，解吸率先上升后下降；乙醇體積分數為70%時，解吸率達到最大值(72.79%)。因此，宜選用70% 的乙醇作洗脫劑。

2.3.3 解吸pH對NAK-Ⅱ樹脂解吸效果的影響 從圖6可以看出，隨著乙醇pH值增大，黃酮解吸率呈下降趨勢。乙醇為極性溶劑，可使大孔樹脂溶脹，降低了樹脂的吸附力，但酸的電離作用可提高乙醇溶液的極性，從而增強大孔樹脂的解吸率。試驗宜選用pH 為3的乙醇為洗脫液。

2.4 太空茄子葉黃酮的動態洗脫曲線

太空茄子葉黃酮的動態洗脫曲線見圖7。當用去42 mL(第20管)洗脫液時，達到洗脫最高峰；當洗脫液用去8 BV(即200 mL時)，洗脫液幾乎呈無色，說明太空茄子葉黃酮已基本解吸完全。表明采用體積分數 70%、pH值為3.0的乙醇溶液可以較好地解吸NKA-II樹脂吸附的太空茄子葉黃酮，同時也表明NKA-II樹脂對太空茄子葉黃酮的靜態試驗結果是可行的。

圖5 乙醇濃度對太空茄葉黃酮解吸率的影響

Figure 5 Effects of ethanol concentrations on desorption rates of flavonoids from eggplant leaves

圖6 解吸pH對太空茄子葉黃酮解吸率的影響Figure 6 Effects of pH on desorption rates of flavonoids from eggplant leaves

圖7 太空茄子葉黃酮的動態洗脫曲線Figure 7 Dynamic elution curve of flavonoids from eggplant leaves

2.5 NKA-II樹脂對太空茄子葉黃酮的純化效果

純化后的太空茄子葉黃酮液經濃縮干燥后為黃色粉末，測定其干物質中黃酮含量為64.59%，而粗品中黃酮含量為17.91%，由此可見，純化后干物質中黃酮質量分數明顯提高，是粗提物的3.61倍。

2.6 對DPPH自由基的清除能力

DPPH·是一種穩定的氮中心自由基，可捕獲(清除)其它自由基，其醇溶液呈現深紫色，中和后會變無色或淺黃色，在517 nm處有一強吸收峰。DPPH·存在單電子，加入樣品后，抗氧化物質釋放的電子與DPPH·配對，使其吸收能力下降，顏色由深變淺。顏色的變化與其接受電子數呈定量關系，因此可以通過褪色程度來衡量清除活性的大小。太空茄子葉黃酮對DPPH·清除力見圖8和表3。

圖8 太空茄子葉黃酮對DPPH·的清除率Figure 8 Scavenging effects of flavonoids from eggplant leaves on DPPH·表3 清除DPPH·的IC50值?Table 3 The IC50 values for scavenging DPPH·

樣品對數回歸方程R2IC50值/(μg·mL-1)蘆丁 y=28.537ln(x)-18.3460.911 310.97純化前黃酮y=28.648ln(x)-33.2850.940 118.31純化后黃酮y=27.782ln(x)-33.7680.966 120.39

?y為DPPH·清除率，%；ln(x)為純化前后對應黃酮或蘆丁質量濃度的對數。

由圖8可知，在試驗范圍內，隨著各樣品質量濃度的增大，DPPH·清除率均呈遞增趨勢。由表3可知，IC50值可確定清除DPPH·能力大小依次為蘆丁>純化前>純化后，說明純化前太空茄子葉黃酮所含的清除DPPH·的成分較純化后多。

2.7 對ABTS+·的清除能力

ABTS+·是一種ABTS經氧化生成穩定的藍綠色水溶性自由基。ABTS+·清除法目前已廣泛用于生物總抗氧化力測定中。當加入樣品后，若含有抗氧化物質提供供氫體，使其溶液顏色變淺，導致在734 nm處的特征吸光度降低。溶液褪色變化與抗氧化劑濃度呈正比，因此依據溶液褪色變化，可以判斷提取物或檢測物的抗氧化能力，太空茄子對ABTS+·的清除能力見圖9和表4。

從圖9可以看出，本試驗范圍內，ABTS+自由基的清除率是隨樣品質量濃度的升高呈上升趨勢，在太空茄子葉黃酮含量為13.4 μg/mL時，ABTS+·清除率趨于平緩，達到97%左右。由表4可知，IC50值可確定ABTS+·清除能力大小依次為蘆丁>純化后>純化前。

3 結論

試驗對太空茄子葉黃酮純化參數及抗氧化活性進行了研究，得出NKA-II是分離純化黃酮的理想吸附劑，吸附平衡時間為2.5 h；解吸平衡時間為40 min；在吸附液pH為2.0、濃度為362.6 μg/mL時吸附能力最強；pH值為3.0、體積分數為70%的乙醇洗脫效果最好，黃酮解吸率隨乙醇體積分數的增加呈先升高后下降的趨勢，此變化趨勢與前人[18]研究結果一致。NKA-II純化后黃酮對ABTS+·清除能力大于純化前，純化后黃酮對DPPH·清除能力則小于純化前，純化前后黃酮對ABTS+·、DPPH·清除能力均小于蘆丁。使用該方法，效率高、成本低、操作簡單，易實現太空茄子葉黃酮工業化生產。后續將對黃酮的組分與結構進行研究，建立NKA-II大孔樹脂吸附黃酮的動態吸附傳質方程，為固定床吸附設備的設計提供參考依據。

圖9 太空茄子葉黃酮對ABTS+·的清除率Figure 9 Scavenging effects of flavonoids from eggplant leaves on ABTS+·表4 清除ABTS+·的IC50值?Table 4 The IC50 values for scavenging ABTS+·

樣品對數回歸方程R2IC50值/(μg·mL-1)蘆丁 y=13.636ln(x)+56.3670.828 40.63純化前黃酮y=19.345ln(x)+37.8010.874 11.88純化后黃酮y=19.069ln(x) + 39.770.885 61.71

?y為ABTS+·清除率，%；ln(x)為純化前后對應黃酮或蘆丁質量濃度的對數。