紫薯不溶性膳食纖維超聲輔助酶法提取工藝及抗氧化活性研究

薛 山

(1. 閩南師范大學生物科學與技術學院，福建 漳州 363000；2. 菌物產業福建省高校工程研究中心，福建 漳州 363000)

紫薯又稱紫甘薯、黑紫薯，是一種源于日本的特殊品種[1]。研究認為紫薯不僅具有非常豐富的膳食纖維，還含有植物多酚、氨基酸、維生素、礦物質，尤其是硒元素等人體需要的營養成分與活性物質[2-4]，對機體抗癌、抗氧化、防輻射、降血壓等方面都發揮著不同程度的功效[5]。目前，有關紫薯方面的研究多涉及紫薯中花青素/花色苷的提取及抗氧化活性測定[6-8]、紫薯全粉加工利用[9-10]、紫薯飲料[11]、紫薯汁糖化[12]、甘薯蜜[13]等方面，而針對紫薯膳食纖維提取方面的報道甚少，且多為水溶性的果膠類物質[14-15]，對于不溶性膳食纖維(Insoluble dietary fiber, IDF)提取的關注有待加強。

膳食纖維(dietary fiber，DF)具有豐富而獨特的性質，是人體必不可少的“第七營養素”[16]。1998年，Saura-Calixto[17]基于此提出了一個新概念——抗氧化膳食纖維，即大量天然抗氧化劑結合到DF基質中的產物。目前，植物性膳食纖維已被證實具有顯著的抗氧化活性[18]，尤其是水不溶性膳食纖維中富含黃酮類(花色素苷、黃烷、黃酮、黃酮醇、黃烷醇)、酚酸(沒食子酸、阿魏酸)以及縮合單寧(聚合的原花色素和高分子量水解鞣質)等天然抗氧化成分[19-21]。因此，本試驗擬以紫薯這一膳食纖維豐富的原料為對象，優化其不溶性膳食纖維的提取工藝，并測定其體外羥自由基清除能力，以期為紫薯的綜合利用與推廣提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

紫薯：漳州市沃爾瑪超市。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑

α-淀粉酶：2.0×104U/g，河南亞統食品原料有限公司；

氫氧化鈉、鹽酸、抗壞血酸、硫酸亞鐵、過氧化氫、水楊酸：分析純，西隴化工股份有限公司。

1.2.2 儀器

高速萬能粉碎機：FW100型，天津市泰斯特儀器有限公司；

實驗室數顯分散均質機：AD500S-H型，上海昂尼儀器儀表有限公司；

精密電子天平：AR224CN型，奧豪斯儀器常州有限公司；

pH計：STARTER 2100型，奧豪斯儀器上海有限公司；

數顯電子恒溫水浴鍋：HH-8型，常州國華電器有限公司；

臺式低速大容量離心機：L550型，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 原料處理 將紫薯去皮、清洗、切成薄片，放入烘箱60 ℃鼓風干燥至恒重，將物料充分粉碎，過40目篩，陰涼干燥處存放以備用。

1.3.2 不溶性膳食纖維的提取 參考文獻[22～23]并略微修改：稱取1.000 g紫薯粉(干重)，按比例加入一定的蒸餾水，充分均質混勻，通過鹽酸(0.325 mol/L)和氫氧化鈉(0.275 mol/L)調節所需要的pH值(中偏酸性)，加入適量的α-淀粉酶溶液(50 mgα-淀粉酶溶解于1 mL pH 6.0的PBS緩沖液中)，用超聲波處理并加熱一段時間，反應完畢后將溶液調至中性。最后，將所得的混合溶液以3 000×g離心10 min，殘渣分別用蒸餾水和無水乙醇洗滌，于105 ℃烘至恒重即得IDF粗提物。提取率按式(1)計算：

(1)

式中：

c——提取率，%；

m1——膳食纖維的干重，g；

m2——紫薯的質量，g。

1.3.3 單因素試驗

(1) 料液比對紫薯IDF提取率的影響：在超聲功率200 W、超聲時間30 min、α-淀粉酶用量50 μL/g、酶解溫度45 ℃的條件下，考察料液比分別為1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30 (g/mL)時，對IDF提取率的影響。

(2) 超聲功率對紫薯IDF提取率的影響：考察超聲功率分別為120，140，160，180，200 W時，對IDF粗提率的影響。料液比為1∶15 (g/mL)，其他反應條件同1.3.3(1)。

(3)α-淀粉酶用量對紫薯IDF提取率的影響：考察α-淀粉酶用量分別為30，40，50，60，70 μL/g時，對IDF粗提率的影響。超聲功率為160 W，其他反應條件同1.3.3(2)。

(4) 超聲時間對紫薯IDF提取率的影響：考察超聲時間分別為10，20，30，40，50 min時，對IDF粗提率的影響。α-淀粉酶用量為50 μL/g，其他反應條件同1.3.3(3)。

(5) 酶解溫度對紫薯IDF提取率的影響：考察酶解溫度分別為30，45，60，75，90 ℃時，對IDF粗提率的影響。超聲時間為40 min，其他反應條件同1.3.3(4)。

1.3.4 多因素試驗 由單因素試驗得到的結果作為依據。將單因素試驗的4個主要因素作為考察對象，設計了四因素三水平表IDF提取的正交試驗。

1.3.5 清除·OH的測定方法 參考陳琬盈等[24]方法配制待測液。在1 000 mL的三角瓶中加入提取的IDF 5.0 g，加水400 mL，攪拌均勻后浸泡l h，加熱液體至沸騰后保持20 min，于13 000 r/min下均質1 min，將乳濁液定容到500 mL 容量瓶。試驗時，根據需要稀釋成不同濃度的待測液。參照固體粉末抗氧化法測定樣品液在Fenton 反應體系產生的羥自由基[25-26]：分別在試管中加入1.0 mL不同濃度的IDF，并依次添加9.0 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液、9.0 mmol/L Fe2+溶液各0.5 mL，加入88 mmol/L H2O25.0 mL 來啟動該反應。振蕩搖勻在37 ℃水浴反應30 min，混合溶液于9 200×g離心2 min，收集上清液于波長510 nm 處測定吸光值。同時，以VC作為陽性對照。清除率按式(2)計算，并換算半數抑制率IC50。

(2)

式中：

P——·OH清除率，%；

A1——0.5 mL水楊酸-乙醇+1.0 mL膳食纖維+0.5 mL Fe2++5.0 mL H2O2混合液的吸光值；

A2——0.5 mL水楊酸-乙醇+1.0 mL膳食纖維+0.5 mL 蒸餾水+5.0 mL H2O2混合液的吸光值；

A3——0.5 mL水楊酸-乙醇+1.0 mL蒸餾水+0.5 mL Fe2++5.0 mL H2O2混合液的吸光值。

1.3.6 數據分析方法 所有數據均用3次平行試驗的“平均值±標準偏差”表示，用 SPSS 17.0軟件對數據進行處理，方差分析中P<0.05為顯著差異，圖中用字母標記法表示。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 料液比對紫薯IDF提取率的影響 由圖1可知，料液比對試驗結果影響顯著(P<0.05)。在料液比為1∶15 (g/mL)時，IDF的提取率達到最大值，而后呈現下降的趨勢。這可能是物料過多，不能在溶液中充分膨脹；物料太少，纖維素容易水解[27]，也可能是隨著料液比的增加，混合體系中的其他物質會競相溶出、相互作用，影響酶反應或膳食纖維分子的穩定性。因此，認為料液比在1∶15 (g/mL)時結果最優。

圖1 料液比對紫薯IDF提取率的影響

Figure 1 Effect of material liquid ratio on the extraction rate of purple sweet potato IDF

2.1.2 超聲功率對紫薯IDF提取率的影響 超聲波作用的功效由原料的數目和結構特性決定，每一種提取物都有其相應的超聲功率的提取值。由圖2可知，超聲波功率在160 W時，IDF的提取率達到最大值。這可能是當超聲波功率提升時，細胞中的IDF溶出，但當超聲波功率過大時，細胞中溶出的物質含有降解IDF的酶，致使提取率降低[28-29]。因此，超聲功率選用160 W。

圖2 超聲功率對紫薯IDF提取率的影響

Figure 2 Effect of ultrasonic power on the extraction rate of purple sweet potato IDF

2.1.3α-淀粉酶用量對紫薯IDF提取率的影響 由圖3可知，隨著α-淀粉酶添加量的增加，紫薯IDF的提取率也隨之升高(P<0.05)。當α-淀粉酶的添加量在50 μL/g時，提取率最高，當α-淀粉酶的添加量繼續增加，IDF的提取率反而降低。推測原因可能是α-淀粉酶添加量過低時，淀粉沒能完全水解，而淀粉酶加入量太高，造成其中的半纖維素等物質溶出，導致提取率下降[30]。故α-淀粉酶的添加量選用50 μL/g。

2.1.4 超聲時間對紫薯IDF提取率的影響 研究[31]認為，超聲波是一種頻率在 20 kHz 以上的聲波，其對媒質主要產生獨特的機械振動作用和空化作用。故超聲輔助溶劑萃取法能夠顯著提高諸多功效成分的提取[31-33]。由圖4可知，超聲時間為10～40 min時，紫薯IDF的提取率與超聲時間呈現正相關趨勢。超聲時間為40 min時，提取率達到峰值。推測可能是超聲時間的延長有助于有效物質的溶出，但當超

圖3 α-淀粉酶用量對紫薯IDF提取率的影響

Figure 3 Effect of the amount of alpha amylase on the extraction rate of purple sweet potato IDF

圖4 超聲時間對紫薯IDF提取率的影響

Figure 4 Effect of ultrasonic time on the extraction rate of purple sweet potato IDF

聲時間過長時，細胞中分解IDF的酶也被溶出，造成提取率降低。故超聲時間選擇40 min。

2.1.5 酶解溫度對紫薯IDF提取率的影響 由圖5可知，IDF的提取率隨著酶解溫度的上升而逐步升高，在75 ℃時提取率最大，當溫度繼續升高，提取率反而迅速下降(P>0.05)。當溫度達到蛋白質變性溫度范圍后，分子快速的運動，使酶牢固的二級和三級結構鍵被打破，該變性作用時常造成蛋白質聚集而導致酶失活[34]。綜上，酶解溫度選擇75 ℃ 比較合適。

2.2 正交因素試驗結果

為了優化提取工藝條件，依據單因素的試驗結果(α-淀粉酶的添加量為50 μL/g)，以紫薯的IDF提取率為指標，選擇超聲功率、超聲時間、酶解溫度、料液比作為考察因素，采用L9(34)正交試驗設計優化工藝。紫薯正交試驗設計表見表1，紫薯正交試驗結果表見表2。

圖5 酶解溫度對紫薯IDF提取率的影響

Figure 5 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on the extraction rate of purple sweet potato IDF

表1 紫薯的正交試驗設計表Table 1 Orthogonal experimental design of purple sweet potato

表2 紫薯的正交試驗結果表Table 2 Results of orthogonal test of purple sweet potato

由表9可知，酶解溫度是超聲波輔助酶法提取紫薯IDF的最關鍵控制因素，其次依次是料液比、超聲波時間和超聲波功率。從k值可知，最優工藝組合是A2B2C2D2，即超聲波功率160 W、超聲波時間40 min、酶解溫度75 ℃、料液比1∶15 (g/mL)。

2.3 最優組合的驗證實驗

依據正交試驗結果和分析可得到提取的最佳工藝條件為：超聲功率160 W、超聲時間40 min、酶解溫度75 ℃、料液比1∶15 (g/mL)。用最佳的工藝組合對紫薯的IDF進行提取，得到提取率為(38.32±0.22)%，證實了A2B2C2D2為最優組合。

2.4 紫薯的IDF對·OH的清除結果

由圖6可知，伴隨濃度的增加，紫薯IDF和VC對·OH的清除率都隨之升高(P<0.05)。紫薯IDF的濃度為1～3 mg/mL，清除率上升較為緩慢，但在3～5 mg/mL時，清除率的上升較為顯著。經計算，紫薯IDF的IC50為39.27 mg/mL，VC的IC50為13.15 mg/mL(圖7)。由此可見，紫薯IDF對·OH有良好的清除效果。

紫薯IDF的抗氧化性主要是基于結合在IDF上的酚類物質[18,35]。孫海燕[3]研究發現，紫薯中的主要酚類物質中類黃酮最高，含量高達 (7.38 ± 0.21) mg/g； 單體酚種類最高達 10 種，其中兒茶素的含量最高為4.54 mg/L。紫羅蘭和秦紫一號2種紫薯均具有較強的抗氧化能力，且紫薯中的各酚類物質均與不同的抗氧化方法有顯著的相關性。蔡湛等[36]評價了紫薯的抗氧化性并通過UPLC-ESI-MS 鑒定出了7種紫薯花色苷和3種其他酚類物質，其中花色苷中?；幕鶊F主要為咖啡酸、阿魏酸和對羥基苯甲酸，其他酚類物質主要是綠原酸。紫薯中的酚類含量不僅遠高于普通甘薯[37]，其花色苷含量也非常豐富，且具有較好的熱穩定性和光穩定性[38]，這些強活性物質有相當一部分會結合在膳食纖維上，成為抗氧化功效發揮的基礎。此外，李潤國等[39]也報道了紫薯膳食纖維對1,1-二苯基-2-苦味?；杂苫?、超氧陰離子自由基以及羥自由基的清除功效。

圖6 紫薯IDF對·OH的清除率Figure 6 The clearance rate of purple sweet potato IDF to ·OH

圖7 紫薯IDF和VC的IC50值Figure 7 IC50 value of purple sweet potato IDF and Vc

3 結論

運用超聲波輔助酶法提取紫薯IDF簡便可行，料液比、超聲時間、超聲功率、α-淀粉酶用量和酶解溫度均能夠影響IDF的提取率，其中酶解溫度對試驗結果的影響最為顯著。正交優化試驗最終得到的提取工藝參數為：α-淀粉酶添加量50 μL/g、料液比1∶15 (g/mL)、超聲時間40 min、超聲功率160 W和酶解溫度75 ℃，該條件下提取率可達38.32%。體外抗氧化試驗表明，紫薯IDF具有較強的羥自由基清除能力。這可能與膳食纖維中結合的花色苷或活性酚類等抗氧化物質有關。

如今，許多果蔬中的抗氧化膳食纖維已廣泛應用于食品保鮮與功能食品研發等領域[40]。紫薯作為良好的膳食纖維來源，具有廣闊的市場前景，亟待更深入的研究和利用。