流動注射化學發光法在線檢測飲用水中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇

楊盼盼 唐書澤 吳事正 李 梁 滕久委

(1. 暨南大學理工學院食品科學與工程系，廣東 廣州 510632；2. 暨南大學國際學院，廣東 廣州 510632)

近年來，突發性水污染事故及人為水中投毒時有發生。中國環境保護部調查顯示， 1996～2006年共有558起水污染事故，其中52%是突發性事件[1-3]。建立應對突發性水污染的快速在線檢測方法，是飲用水安全預警，科學判斷，正確處理，預防重大食品安全突發事故急需研究的課題。

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)又名嘔吐毒素，屬于B族單端孢霉烯族化合物，由禾谷鐮刀菌、黃色鐮刀菌等真菌產生，主要來源于受污染的谷物[4-5]。人與動物食用少量受DON污染的食物后，會產生中毒癥狀，例如體重減少、拒食、惡心、嘔吐等，長期攝入可導致免疫功能受損，甚至引發更嚴重疾病[6-7]。DON溶于水，易在谷物中富集，是飲用水的一種潛在污染毒素[8-9]。

檢測DON的方法主要有高效液相色譜法(HPLC)[10-11]、氣相色譜-質譜聯用法(GC-MS)[12]、酶聯免疫法(ELISA)[13]、高光譜圖像[14]、化學發光磁酶免疫法[15]等。這些方法存在儀器價格昂貴、耗時、重復性差等缺點。流動注射化學發光法具有檢測限低，靈敏度高，檢測速度快、線性范圍寬等優點[16-17]。本課題組前期研究開發了針對秋水仙堿[18]、3-硝基丙酸[19]、黃綠青霉素[20]等毒素的流動注射化學發光快速檢測方法。本研究擬基于DON對魯米諾-過氧化氫化學發光體系的增強作用，建立一種用于飲用水中DON突發性污染的快速在線檢測方法。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

1.1.1 主要儀器設備

蠕動泵：BT100-1F型，保定蘭格恒流泵有限公司；

微弱發光測量儀：BPCL-K型，北京亞泊斯科技有限公司；

六通閥：C22Z型，美國VICI公司；

紫外、可見、近紅外分光光度計：UV-3600Plus型，日本島津有限公司。

1.1.2 主要試劑

魯米諾、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇：分析純，美國Sigma公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 進樣方法 DON流動注射化學發光測定流程圖見圖1。過氧化氫溶液、魯米諾溶液、表面活性劑溶液及樣品DON溶液在蠕動泵的推動下進入六通閥，通過調節六通閥，使各流路在流通池中均勻混合，并發生化學發光反應，光電倍增管捕捉并擴大發光信號，然后通過信號分析器，將光信號轉換成電信號后，輸送至計算機，利用計算機內所裝的微弱發光測量系統專用軟件，對樣品進行發光強度測量，從而進行樣品DON分析。

A. 過氧化氫溶液 B. 魯米諾溶液 C. 表面活性劑溶液 D. DON溶液 P. 蠕動泵 V. 六通閥 F. 流通池 PMT. 光電倍增管 NHV. 負高壓 W. 廢液

圖1 流動注射化學發光流程圖

Figure 1 Schematic diagram of flow-injection chemiluminescence system

1.2.2 流路及其參數選擇

(1) 蠕動泵泵前管路選擇：在流速17 mL/min，過氧化氫濃度0.1 mol/L，氫氧化鈉濃度0.1 mol/L，魯米諾濃度1×10-5mol/L，表面活性劑濃度10%，DON濃度 0.2 mg/L的條件下，分別調節泵前長度20，30，40 cm，觀察液體能否從燒杯進入到軟管中。

(2) 蠕動泵流速選擇：在泵前長度30 cm，過氧化氫濃度0.1 mol/L，氫氧化鈉濃度0.1 mol/L，魯米諾濃度1×10-5mol/L，表面活性劑濃度10%，DON濃度0.2 mg/L的條件下，分別調節泵速為5，7，9，11，13，15，17 mL/min，觀察化學發光所需的時間及化學發光強度，確定最佳的流速。

1.2.3 表面活性劑選擇 在光電倍增管負高壓為750 V，過氧化氫濃度0.1 mol/L，氫氧化鈉濃度0.1 mol/L，魯米諾濃度1×10-5mol/L，DON濃度 0.2 mg/L的條件下，表面活性劑分別選擇10%吐溫80、10%卵磷脂、10%十二烷基硫酸鈉(Sodium dodecyl sulfate，SDS)、10%十六烷基三甲基溴化銨 (Hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB)，考察不同表面活性劑對化學發光強度的影響。

1.2.4 單因素試驗 影響化學發光強度的主要因素有氫氧化鈉濃度、魯米諾濃度、過氧化氫濃度、吐溫80濃度。單因素試驗流程和參數分別見1.2.1、1.2.2，光電倍增管負高壓750 V，分別考察各因素對化學發光強度的影響。

(1) 氫氧化鈉濃度的選擇：在過氧化氫濃度0.1 mol/L，魯米諾濃度1×10-5mol/L，吐溫80濃度10%、DON濃度 0.2 mg/L的條件下，分別考察氫氧化鈉在0.01，0.02，0.03，0.04，0.05 mol/L時的化學發光強度。

(2) 魯米諾濃度的選擇：在過氧化氫濃度0.1 mol/L，氫氧化鈉濃度0.02 mol/L，吐溫80濃度10%，DON濃度 0.2 mg/L 的條件下，分別考察魯米諾在2×10-4，4×10-4，6×10-4，8×10-4，1×10-3mol/L時的化學發光強度。

(3) 過氧化氫濃度的選擇：在氫氧化鈉濃度0.02 mol/L，魯米諾濃度8×10-4mol/L，吐溫80濃度10%，DON濃度0.2 mg/L 的條件下，分別考察過氧化氫濃度0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mol/L時的化學發光強度。

(4) 吐溫80濃度的選擇：在氫氧化鈉濃度0.02 mol/L，過氧化氫濃度0.6 mol/L，魯米諾濃度8×10-4mol/L，DON濃度0.2 mg/L的條件下，分別考察吐溫80濃度為2%，4%，6%，8%，10%時的化學發光強度。

1.2.5 響應面設計 依據單因素試驗結果，利用Box-Behnken中心組合設計原理，對試驗有影響的4個因素，即氫氧化鈉濃度、魯米諾濃度、過氧化氫濃度和吐溫80濃度進行四因素三水平響應面優化試驗，用Design Expert 8.0軟件對試驗數據進行回歸分析。

1.2.6 標準曲線繪制、精密度及檢出限確定 在優化試驗條件下，測定DON濃度在0.001～4.000 mg/L時的化學發光強度。以DON的濃度為橫坐標，發光強度為縱坐標繪制標準曲線，并計算精密度和檢出限。

1.2.7 回收率測定 在優化試驗條件下，分別在自來水和蒸餾水中加入定量的DON，測定回收率，并對自來水中的干擾離子進行分析。

2 結果與討論

2.1 反應機理探討

魯米諾-過氧化氫體系在堿性溶液中的發光機理已有報道[21-23]。在本試驗中，為了探討發光機理，利用紫外、可見、近紅外分光光度計在190～400 nm下對4種溶液進行紫外吸收光譜分析，結果見圖2。魯米諾—過氧化氫分別在289，345 nm處有2個峰，分別加入DON和吐溫80后，峰的位置基本沒有變化，也無其他峰出現，說明加入DON和吐溫80后沒有生成新的物質，DON和吐溫80在這一體系中可能起到催化的作用。反應機制可能為：① 魯米諾和過氧化氫在堿性的條件下，形成陰離子；② 由于吐溫80的存在，改變了化學發光反應的微環境；③ 由于微環境中膠束的存在，3-氨基鄰苯二甲酸根被富集，導致激發態中間體的壽命延長和產率增加[24]，從而增強體系的化學發光強度。

2.2 流路及其參數的選擇

2.2.1 蠕動泵泵前管路的選擇 試驗使用的驅流裝置為蠕動泵，在試驗過程中，蠕動泵前管路過長或者過短，都會由于壓力的原因使液體無法進入管中。因此試驗得到蠕動泵前管路最佳長度為30 cm。

2.2.2 蠕動泵流速選擇 蠕動泵的流速是影響試驗的重要參數。由圖3可知，在流動注射過程中，在泵速13 mL/min時，化學發光強度達到最大值，在泵速較慢或較快的情況下，化學發光強度偏低。原因可能是當泵速較慢時，化學發光反應已經在流路中發生，因此檢測器捕捉不到或只能捕捉到較小的發光信號；當泵速過快時，溶液沒有完全發生反應而被流走，因此得到最佳泵速為13 mL/min。

圖2 紫外-可見吸收光譜圖Figure 2 UV-Vis absorption spectrum of CL system

圖3 蠕動泵流速的選擇Figure 3 Selection of peristaltic pump flow rate

2.3 表面活性劑的選擇

表面活性劑具有增溶、提高靈敏度、改變溶液介電常數和增強體系穩定的作用[25]。由表1可知，在DON 0.2 mg/L時，吐溫80、卵磷脂、SDS和CTAB對魯米諾—過氧化氫體系有增敏作用，吐溫80增敏效果最為顯著。CTAB在反應過程中出現白色沉淀，可能是由于反應的產物不能溶解于該體系，這與文獻[26]報道一致。因此選擇吐溫80作為該體系的增敏劑。

2.4 化學發光動力學曲線

魯米諾—過氧化氫的化學體系見圖4。在魯米諾—過氧化氫體系中加入DON，化學發光強度增加，說明DON對該體系有促進作用。吐溫80作為增敏劑，添加到魯米諾—過氧化氫—DON體系中，有顯著促進作用，因此，試驗選擇魯米諾—過氧化氫—吐溫80體系對DON進行檢測。

表1 表面活性劑對DON的化學發光強度的影響Table 1 Effect of surfactants on chemiluminescence of DON

圖4 化學發光動力學曲線Figure 4 Curve of the chemiluminescence system

2.5 單因素試驗

2.5.1 氫氧化鈉濃度的選擇 在堿性條件下，魯米諾發生化學發光反應，因此采用氫氧化鈉作為堿溶液[27]。由圖5可知，當氫氧化鈉濃度為0.02 mol/L時，化學發光強度最大，隨后發光強度降低，可能加入吐溫80以后，在靜電作用和膠束作用下，溶液中的氫氧根離子被局部富集，膠束中的堿性增強，反應所需的pH降低[25]。因此選擇0.02 mol/L為氫氧化鈉的最適濃度。

圖5 氫氧化鈉濃度與化學發光強度的關系

Figure 5 Relationship between sodium hydroxide concentration and chemiluminescence intensity

2.5.2 魯米諾濃度的選擇 魯米諾濃度對化學發光強度的影響見圖6，在魯米諾濃度2×10-4～8×10-4mol/L時，化學發光強度隨魯米諾濃度增大而增強，當魯米諾濃度為8×10-4mol/L時，化學發光強度達到最大，因此選擇魯米諾濃度為8×10-4mol/L。

2.5.3 過氧化氫濃度的選擇 過氧化氫在化學發光體系中作為氧化劑，直接影響發光強度。如圖7所示，體系的發光強度隨過氧化氫濃度先升高再降低，在過氧化氫濃度為0.6 mol/L 時，化學發光強度達到最大值，可能由于在堿性條件下，過氧化氫易分解形成陰離子，同時，魯米諾以陰離子的形式存在，離子在吐溫80表面聚集，導致周圍離子濃度升高，反應速率會提升，所以發光強度迅速升高，而濃度過高會產生抑制作用，導致發光強度的降低。因此，選取0.6 mol/L 為過氧化氫最適濃度。

圖6 魯米諾濃度與化學發光強度的關系

Figure 6 Relationship between luminol concentration and chemiluminescence intensity

圖7 過氧化氫濃度與化學發光強度的關系

Figure 7 Relationship between hydrogen peroxide concentration and chemiluminescence intensity

2.5.4 吐溫80濃度的選擇 由圖8可知，發光強度隨著吐溫80濃度的增加而上升，當吐溫80濃度達到8%時，化學發 光強度達到最大，隨后發光強度迅速下降，其原因可能是濃度過高的吐溫80改變了化學發光的微環境，并且吐溫80濃度增加，黏稠度增加，不利于魯米諾與過氧化氫的混合，導致發光強度的降低。因此，選擇吐溫80最適濃度為8%。

圖8 吐溫80濃度與化學發光強度的關系

Figure 8 Relationship between Tween 80 concentration and chemiluminescence intensity

2.6 響應面試驗結果

2.6.1 響應面模型建立 根據單因素試驗結果，以氫氧化鈉濃度、魯米諾濃度、過氧化氫濃度、吐溫80濃度4個因素為自變量，以化學發光強度為響應值，進行響應面的分析試驗。試驗方案和結果分別見表2、3。

2.6.2 多元二次響應面回歸模型建立與分析 對表3試驗結果通過Design-Expert軟件程序進行二次回歸響應面分析， 建立多元二次響應面模型：

表2 響應面優化試驗的因素和水平Table 2 Factors and levels of response surface design

表3 響應面試驗設計及結果Table 3 Response surface experimental design and results

Y=-1.612 96×107+5.827 54×107A-1.128 89×109B+3.644 39×106C+3.54 120×1010D+5.301 97×107AB+4.152 60×106AC+1.964 75×109AD+8.716 33×107BC+4 108.333 33CD-3.343 38×109A2-8.698 98×1011B2-5.944 02×106C2-2.360 98×105D2。

(1)

表4為回歸方程分析結果。模型P=0.000 2<0.010 0，表明該擬合模型極顯著。失擬項為P=0. 390 5>0.050 0，即模型失擬度不顯著，說明該方程對試驗的擬合程度好，具有較高的準確度，可用于給定條件下化學發光強度的測量。而模型中一次項A的P值<0.01，說明氫氧化鈉濃度對試驗結果影響極顯著，交互項中BC的P值<0.05，說明魯米諾濃度與過氧化氫濃度交互作用顯著。

2.6.3 響應面分析 圖9中(a)～(f)直觀反映了任何兩個因素交互作用對化學發光強度的影響。由圖9可知，氫氧化鈉濃度對應的響應面坡面坡度相對陡峭，說明其對發光強度影響較大。這與表4中的分析結果一致。

2.6.4 響應面中最優檢測條件預測和驗證 通過軟件的最優化預測功能，得到理論上的最佳檢測條件：氫氧化鈉濃度0.02 mol/L，魯米諾濃度1×10-3mol/L，過氧化氫濃度0.7 mol/L，吐溫80濃度8.13%，該條件下化學發光強度為465 378。為滿足實際操作需求，將檢測條件調整：氫氧化鈉濃度0.02 mol/L，魯米諾濃度1×10-3mol/L，過氧化氫濃度0.7 mol/L，吐溫80濃度8%。在此條件下進行5次平行檢測試驗，得到化學發光強度平均值為459 116.3，與預測值相比，相對標準差為2.9%。因此響應面建立的模型真實可靠，可用于脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的檢測。

2.7 標準曲線、精密度及檢出限

在優化試驗條件下，以DON濃度為橫坐標，化學發光強度為縱坐標繪制標準曲線(圖10)。試驗結果表明， DON濃度在0.001～4.000 mg/L時，具有良好的線性關系，線性方程：y=55 903.54x+426 996.48，R2=0.998。同時對0.2 mg/L 的DON進行11次平行測定，相對標準差(RSD)為1.89%。根據IUPAC的規定，計算出檢出限為0.001 mg/L。

2.8 加標回收試驗結果

以屈臣氏蒸餾水、實驗室自來水在試驗優化條件下測定樣本中DON含量，再通過加入標準樣品測定回收率，結果見表5。加標回收率為67.33%～94.50%，自來水回收率較差，原因可能是自來水中含有次氯酸根離子與部分的魯米諾發生反應，導致魯米諾被消耗，檢測到的發光強度降低。此外還存在一些金屬離子對發光體系的干擾，為了消除干擾作用，根據本課題組之前的研究結果，可以在每100 mL樣品溶液中添加0.007 5 mg的乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)作為掩蔽劑[19]。

圖10 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的標準曲線Figure 10 Calibration graphs for DON表4 回歸方程方差分析結果?Table 4 Analysis of variance from regression equation

方差來源自由度平方和均方F值P值顯著性模型145.151×10113.679×10107.850.000 2**A15.739×10105.739×101012.250.003 5**B12.881×1092.881×1090.610.446 0C11.041×10101.041×10102.160.163 4D15.845×1095.845×1091.250.282 8AB12.044×10102.044×10104.360.055 5AC11.061×10101.061×10102.270.154 5AD11.724×1091.724×1090.370.553 7BC13.092×10103.092×10106.600.022 3*BD11.219×1091.219×1090.260.618 0CD16.752×1056.752×1051.441×10-40.990 6A211.971×10101.971×10104.210.059 5B211.208×10101.208×10102.580.130 6C213.487×10103.487×10107.440.016 3*D213.680×10113.680×101178.550.000 1**殘差146.558×10104.658×109失擬項105.124×10105.124×1091.430.390 5純誤差41.434×10103.585×109總和285.807×1011

? *表示差異顯著，P<0.05；**表示差異極顯著，P<0.01。

圖9 4種因素交互作用的響應面分析結果Figure 9 Response surface analysis of interaction of four factors表5 樣品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的加標回收率試驗Table 5 Results for the determination of DON in water sample(n=3)

樣品加標量/(mg·L-1)檢出值/(mg·L-1)回收率/%RSD/%自來水0.00.0000.20.134±0.00067.332.344.03.002±0.01075.550.25屈臣氏蒸餾水0.00.0000.20.189±0.00394.501.084.03.620±0.01090.610.33

3 結論

本試驗利用DON對魯米諾-過氧化氫體系的促進作用，建立了一種流動注射化學發光檢測DON的新方法。與現有檢測方法相比，流動注射化學發光法具有操作簡便、快速、效率高、在線連續檢測等優點，可應用于DON突發性水污染快速檢測。目前，流動注射化學發光法只能監測單一的物質，不能檢測混合物。后續可通過質譜、核磁等技術手段對化學發光反應機理作進一步探究，以期解決混合物檢測的問題。