實驗性家兔頸動脈粥樣硬化模型中頸動脈I/M值與腎動脈粥樣硬化的相關性研究

陳徐亮　周野　楊鵬麟

[摘要] 目的 分析實驗性家兔頸動脈粥樣硬化模型中頸動脈內膜/中膜（I/M）比值變化與腎動脈粥樣硬化的相關性。 方法 將48只家兔以隨機數字表法分為空白組、對照組、模型組，各16只。空白組不給予任何干預，維持喂飼基礎飼料；對照組給予高脂飼料120 g/d；模型組給予高脂飼料飼養7 d后，于禁食（不禁水）12 h后實施頸動脈內膜空氣干燥術使其成為雙側頸動脈粥樣硬化模型。獲取所有家兔雙側手術段頸動脈、腎動脈標本，常規石蠟包埋、切片、HE染色后分析I/M值，并在實驗結束時測定血清三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、C反應蛋白（CRP）水平，分析尿微量白蛋白/尿肌酐（UACR）比值，并進行相關性分析。 結果 空白組家兔頸動脈、腎動脈光鏡下HE染色正常；對照組頸動脈可見輕微內膜增生，腎動脈僅可見輕度增生狹窄，但無明顯脂質沉積；模型組頸動脈內膜明顯增生增厚，內膜下大量泡沫細胞堆積，腎動脈內膜廣泛顯著增生，血管內徑嚴重狹窄，高倍鏡下可見增厚內膜為泡沫細胞堆積。與空白組比較，對照組和模型組家兔頸動脈、腎動脈I/M值均明顯升高，血清TG、TC、CRP及UACR均明顯升高，且模型組家兔頸動脈、腎動脈I/M值及血清TG、TC、CRP、UACR均明顯高于對照組，差異有統計學意義（P < 0.05）。家兔頸動脈粥樣硬化模型頸動脈I/M值與腎動脈I/M值、CRP、UACR呈正相關（P < 0.05），與TG、TC相關性不明顯（P > 0.05）。 結論 頸動脈粥樣硬化可促進腎動脈粥樣硬化發生，可能與機體炎性反應、血管內皮細胞損傷、腎臟血管病變等有關。

[關鍵詞] 家兔；頸動脈粥樣硬化；內膜/中膜比值；腎動脈粥樣硬化；相關性

[中圖分類號] R543.5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）04（b）-0012-05

Study on the correlation between the carotid I/M ratio and renal atherosclerosis in experimental rabbit carotid atherosclerosis models

CHEN Xuliang ZHOU Ye YANG Penglin

Department of Cardiovascular Medicine， the Second Hospital Affiliated to Wenzhou Medical University， Zhejiang Province， Wenzhou 325000， China

[Abstract] Objective To analyze the correlation between the change in carotid intima / media membrane （I/M） ratio and renal atherosclerosis in experimental rabbit carotid atherosclerosis models. Methods Forty-eight rabbits were randomly divided into the blank group， the control group and the model group by the random number table method， with 16 rabbits in each group. The blank group was not given any intervention， which was given basal feed. The control group was given high-fat diet of 120 g/d. The model group was given 7 d of high-fat diet and then the rabbits were changed into bilateral carotid atherosclerosis models through carotid intima air drying after 12 h of fasting （without fasting water）. The bilateral operative carotid arteries and renal artery specimens of all rabbits were obtained to analyze the I/M ratio after routine paraffin embedding， sectioning and HE staining. Serum levels of triglyceride （TG）， total cholesterol （TC） and C-reactive protein （CRP） were determined at the end of the experiment. Urinary microalbumin / urine creatinine （UACR） was analyzed and correlation analysis was performed. Results HE staining under light microscope was normal in the carotid artery and renal artery of rabbits in the blank group. In the control group， there was slight intimal hyperplasia in the carotid artery and slight hyperplasia and stenosis in the renal artery， without obvious lipid deposition. In the model group， there was obviously proliferated and thickened carotid intima， a large number of foam cells accumulated in the intima， extensively proliferated intima of the renal artery and seriously narrowed vessels， and thickened intima was accumulated foam cells at high magnification. Compared with the blank group， the carotid artery， renal artery I/M ratio in the control group and model group were significantly increased， serum TG， TC， CRP and UACR were significantly increased， and the carotid artery， renal artery I/M ratio and serum TG， TC， CRP and UACR in the model group were significantly higher than those of control group， the differences were statistically significant （P < 0.05）. The I/M ratio of carotid artery in rabbit carotid atherosclerosis models was positively correlated with the I/M ratio of renal artery， CRP and UACR （P < 0.05）， but there was no significant correlation with TG or TC （P > 0.05）. Conclusion Carotid atherosclerosis can promote the occurrence of renal atherosclerosis， which may be related to inflammatory reactions， vascular endothelial cell injury and renal vascular diseases.

[Key words] Rabbit； Carotid atherosclerosis； Intima / media membrane ratio； Renal atherosclerosis； Correlation

動脈粥樣硬化一般指某些部位內膜下脂質沉積（伴平滑肌細胞增殖、纖維基質成分增加）引起的管壁增厚、變硬及管腔狹窄病變[1]，其主要累及全身主動脈、頸動脈、腦動脈、腎動脈等大中型彈力動脈、肌彈力動脈，是導致臨床多種心血管疾病（腦梗死、冠心病等）發生的獨立危險因素[2]。其中頸動脈作為粥樣硬化最常見病變部位之一，近年來臨床發生率居高不下。因其處于淺表位置，易被B超、CT、MRI等檢查發現并確診。國內外已有學者[3-5]針對頸動脈粥樣硬化與全身其他部位血管如主動脈、腦動脈、冠狀動脈、股動脈等的粥樣硬化之間的關系展開相關研究，并證實頸動脈粥樣硬化與全身動脈粥樣硬化幾乎都有一定的相關性，但其仍處于初步研究階段，動物實驗相對不足，尤其是其與腎動脈內膜/中膜（intima/media membrane，I/M）關系的文獻報道相對較少。為此，本研究采用頸動脈空氣干燥法制作家兔頸動脈粥樣硬化模型，對比分析不同模型家兔頸、腎動脈I/M比值及其他生化指標，并分析頸、腎動脈I/M的相關性，以期進一步充實臨床實驗，并為動脈粥樣硬化的臨床研究與防治提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取48只SPF級雄性日本大耳白兔（JW兔，溫州醫科大學實驗動物中心提供，合格證號：0035204），體重2.0～2.5 kg，平均（2.20±0.14）kg，均為4月齡，一般狀態良好，皮毛光澤，進食與活動正常，均于實驗室適應性喂養7 d，適應性喂養的條件以青菜、植物根莖葉等青粗飼料喂養，溫度10～15℃，濕度65%～80%。動物的使用經溫州醫科大學附屬第二醫院倫理委員會審核通過。

1.2 主要試劑及儀器

總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）（化學純）購自上海博光生物科技有限公司，批號為080102、081108；C反應蛋白（CRP）測定試劑盒購自杭州伊利康生物公司，批號為031008；HE染色試劑來源于溫州醫科大學附屬第二醫院病理科，批號為090812；AngⅡ放免檢測試劑盒購自北京原子高科股份有限公司，批號為110205。儀器包括Olympus PM10-SP-35光學顯微鏡、LD4-2A臺式離心機、羅氏Modular全自動生化分析儀、LumiStation-1500L型單管陣列式化學發光儀。

1.3 方法

1.3.1 分組方法 將48只家兔以隨機數字表法分為空白組、對照組、模型組三組，各16只。空白組不給予任何干預，維持喂飼基礎飼料。對照組給予高脂飼料120 g/d，連續喂飼10周，飲水不限；高脂飼料配方由87%基礎飼料、2%膽固醇、8%豬油及2%蛋黃粉組成。模型組在給予高脂飼料喂養的基礎上加頸動脈內膜空氣干燥術造成家兔雙側頸動脈粥樣硬化模型。

1.3.2 家兔雙側頸動脈粥樣硬化模型建立方法 參考文獻[6-7]實施頸動脈內膜空氣干燥術，模型組家兔給予高脂飼料飼養7 d后，于術前12 h時給予禁食（不禁水），先給予3%戊巴比妥靜脈麻醉和常規頸部脫毛消毒；然后自頸部正中作切口，鈍性分離，使兩側頸總動脈暴露良好，鈍性分離右側頸總動脈至頸總動脈分叉前1 cm處（長約2 cm），兩側分別以動脈夾臨時夾閉。接下來以皮試針頭（皮試針頭連接抽有生理鹽水的注射器）平行于血管縱軸方向穿刺進入以阻斷血管，注入生理鹽水灌洗血管腔，其次以皮試針頭向夾閉段的頸總動脈行空氣干燥術，150 mL/min干燥10 min，干燥后重新注入生理鹽水，拔出皮試針頭并松開動脈夾，恢復頸總動脈的血流，給予常規止血輕壓；最后以上述方法對左側頸動脈實施空氣干燥術，完成后給予青霉素局部抗感染，縫合切口，建模完成。以內皮細胞功能障礙及變性、內膜明顯增生為造模成功。見圖1。

1.4 病理標本獲取

三組家兔均放血處死，獲取雙側手術段（空白度、對照組以模型組對應位置為參考）頸動脈各0.5 cm，距兩側腎動脈起始處約0.5 cm各取1段0.3 cm長的腎動脈，生理鹽水沖洗后置于4%的多聚甲醛中固定24 h（4℃，pH 7.4），石蠟包埋后切片（厚度4 μm），常規HE染色。

1.5 腎動脈I/M值測定

將HE染色處理后的病理標本通過Image pro plus 6.0軟件分析I/M值。頸動脈、腎動脈每個切面在顯微鏡下均任意取10個視野測I/M值后取平均數表示該切面的頸動脈、腎動脈I/M值，再次取左右兩側I/M值的平均數作為此家兔最終的頸動脈、腎動脈I/M值。

1.6 生化指標測定

三組家兔均在實驗結束時（第10周末，但在處死前）經耳緣靜脈采血2 mL，3000 r/min離心處理5 min（離心半徑15 cm），采用全自動生化分析儀測定血清TG、TC水平，以酶聯免疫吸附法測定CRP水平。同時，取家兔禁食8 h后尿液，采用化學發光儀和酶促化學發光法檢測尿微量白蛋白、尿肌酐水平，分析尿微量白蛋白/尿肌酐（UACR）。

1.7 統計學方法

研究數據選用統計學軟件SPSS 19.0分析和處理，計量資料采取均數±標準差（x±s）表示，組間頸動脈、腎動脈I/M值、血脂水平、CRP、UACR等對比進行t、F檢驗；采用Pearson相關系數來評價家兔頸動脈粥樣硬化模型頸動脈I/M值與腎動脈I/M值、血脂水平、CRP、UACR的關系；以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 病理及頸動脈、腎動脈I/M值結果

空白組家兔頸動脈、腎動脈單層內皮細胞完整，中層平滑肌細胞排列整齊，內膜光滑；對照組頸動脈可見輕微內膜增生，腎動脈僅可見輕度增生狹窄，但無明顯脂質沉積；模型組頸動脈內膜明顯增生增厚，內膜下大量泡沫細胞堆積，腎動脈內膜廣泛顯著增生，血管內徑嚴重狹窄，高倍鏡下可見增厚內膜泡沫細胞堆積。見圖2。與空白組比較，對照組和模型組家兔頸動脈、腎動脈I/M值均明顯升高，且模型組家兔頸動脈、腎動脈I/M值均明顯高于對照組，差異有統計學意義（P < 0.05）。見表1。

2.2 生化指標測定結果

實驗結束時，與空白組比較，對照組和模型組家兔血清TG、TC、CRP及UACR均明顯升高，且模型組家兔血清TG、TC、CRP及UACR明顯高于對照組，差異有統計學意義（P < 0.05）。見表2。

2.3 相關性分析結果

家兔頸動脈粥樣硬化模型頸動脈I/M值與腎動脈I/M值、CRP、UACR呈正相關（r = 0.36、0.44、0.69，均P < 0.05），與TG、TC無明顯相關性（r = 0.28、0.25， 均P > 0.05）。

3 討論

頸動脈粥樣硬化是全身動脈粥樣硬化的主要表現之一，其發生的影響因素包括高齡、脂質、血糖代謝紊亂、神經體液調節異常、血流動力學變異等，是導致冠心病的主要病因[8-9]。腎臟在機體的幾個重要的臟器中比較獨特，對灌注壓減少過程中缺氧的組織具有保護作用，而腎動脈粥樣硬化可導致腎動脈狹窄甚至完全閉塞，累及腎動脈開口及近段，并呈進行性加重，最終引起腎血管性高血壓、腎功能損害甚至終末期腎病或腎功能衰竭[10]。故近幾年來對于動脈粥樣硬化的發病機制及防治策略的研究和探討一直是國內外醫學界的熱門話題，而目前關于頸動脈粥樣硬化與腎動脈粥樣硬化的關系報道極為少見，國內僅有少量報道，如張若青等[11]的報道明確指出，頸動脈與冠脈、腎動脈粥樣硬化之間存在共同的危險因素；周葉等[12]的研究結果顯示頸動脈粥樣硬化預測腎動脈狹窄的靈敏度較高，特異度偏低。而國外早期就有學者[13]分析指出，頸動脈、腎動脈粥樣硬化之間存在共同的危險因素，如血脂代謝異常、內皮血管損傷等；Hoke等[14]證實無癥狀頸動脈粥樣硬化患者的腎功能與正常人相比存在損傷，且可導致患者遠期死亡率增加；而Geraci等[15]的近期研究明確證實高血壓頸動脈粥樣硬化與腎動脈粥樣硬化關系密切，主要體現在其明顯影響患者的脈壓及腎臟血流動力學。

在以往研究基礎上，為進一步明確二者的關系，本研究將48只家兔隨機分為空白組、對照組、模型組，各16只，空白組不給予任何干預，對照組給予高脂飼料，模型組在給予高脂飼料基礎上加頸動脈內膜空氣干燥術造成雙側頸動脈粥樣硬化模型。分析結果顯示，空白組家兔頸動脈、腎動脈光鏡下HE染色正常，對照組頸動脈可見輕微內膜增生，腎動脈僅可見輕度增生狹窄，但無明顯脂質沉積；模型組頸動脈內膜明顯增生增厚，內膜下大量泡沫細胞堆積，腎動脈內膜廣泛顯著增生，血管內徑嚴重狹窄，高倍鏡下可見增厚內膜為泡沫細胞堆積。提示頸動脈粥樣硬化模型組家兔除了頸動脈發生病理變化外，腎動脈亦出現內膜增生、內徑狹窄等病變。同時，空白組、對照組、模型組家兔頸動脈I/M值、腎動脈I/M值依次明顯升高，提示頸動脈、腎動脈粥樣硬化存在一定關系。為進一步證實這一觀點，本研究在實驗結束時檢測三組血清TG、TC、CRP及UACR，發現與空白組、對照組相比，模型組家兔血清TG、TC、CRP及UACR明顯升高，其中TG、TC為血脂指標，可反映家兔經過10周喂飼后血脂代謝情況；CRP為非特異性的炎癥標志物，大量臨床研究證實其在動脈粥樣硬化病灶和血清中都有明顯升高[16-19]，宋筱靚等[20]認為，CRP與動脈粥樣硬化的存在和嚴重性有明顯相關性，其水平的下降從某種程度上能反映抗動脈粥樣硬化的效果。而UACR除了可反映腎臟血管早期病變以外，還可用于評估全身血管內皮細胞損傷情況，而腎動脈粥樣硬化患者長期處于腎動脈狹窄狀態下易導致血管內皮細胞功能損傷，內皮細胞表面受體結合促使血管內皮通透性增加，導致血管舒張功能降低，血管壁結構、功能受損[21-23]。經過相關性分析，本研究發現家兔頸動脈粥樣硬化模型頸動脈I/M值與腎動脈I/M值、CRP、UACR呈正相關，與TG、TC相關性不明顯，推斷頸動脈粥樣硬化可能促使機體發生炎性反應，加速血管內皮細胞損傷，誘發腎臟血管病變，從而導致腎動脈粥樣硬化的發生風險增高。此外，本研究中頸動脈I/M值與TG、TC水平相關性不明顯，主要與對照組、模型組喂飼相同有關，但并不排除血脂異常對腎動脈粥樣硬化的發生無影響。

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（收稿日期：2017-12-21 本文編輯：張瑜杰）