丹參酮ⅡA對萬古霉素損傷HK—2細胞凋亡的影響及其機制的研究

席加喜　張華君　陳曉宇

[摘要] 目的 觀察丹參酮ⅡA（TSⅡA）對萬古霉素（VAN）損傷的人腎小管上皮細胞（HK-2）細胞凋亡的影響，探討其可能機制。 方法 體外傳代培養HK-2細胞，常規培養至細胞數約為1×106個/mL，分為空白組、VAN組、TSⅡAL組、TSⅡAM組、TSⅡAH組，除空白組加入PBS溶液外，其他各組加入終濃度為100 μg/L VAN建立VAN損傷HK-2細胞模型，培養24 h后，空白組、模型組加入等體積的PBS溶液，TSⅡ-A各劑量組分別加入不同濃度的TSⅡA，繼續培養24 h。MTT法測定細胞存活率，比色法測定細胞懸液中乳酸脫氫酶（LDH）、過氧化氫酶（CAT）活性；熒光素DCFH-DA探針法測定細胞內ROS含量，Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡率。 結果 與空白組比較，VAN組細胞存活率、CAT活性顯著降低，LDH活性和細胞內ROS水平顯著升高，細胞凋亡率明顯增加（P < 0.05）；與VAN組比較，TSⅡAL組、TSⅡAM組、TSⅡAH組的細胞存活率、CAT活性顯著升高，LDH活性和細胞內ROS水平顯著降低，細胞凋亡率明顯減少（P < 0.05），且作用均有濃度依賴性。 結論 TSⅡA磺酸鈉注射液能顯著提高VAN損傷HK-2細胞的存活率，減少VAN損傷的HK-2細胞的凋亡，其機制可能與降低VAN損傷HK-2細胞LDH水平和細胞內的ROS水平及升高CAT等氧化應激反應有關。

[關鍵詞] 萬古霉素；丹參酮ⅡA；細胞凋亡；機制；HK-2細胞

[中圖分類號] R285.5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）04（b）-0008-04

Effect of TanshinoneⅡA Sulfonate Injection against HK-2 apoptosis induced by Vancomycin and the probable mechanism

XI Jiaxi ZHANG Huajun CHEN Xiaoyu

Department of Pharmacy， the People′s Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region， Guangxi Zhuang Autonomous Region， Nanning 530021， China

[Abstract] Objective To explore the effect of TanshinoneⅡA Sulfonate Injection against HK-2 cell damage induced by Vancomycin and the probable mechanism. Methods HK-2 cells were cultured in vitro till the number was up to 1×106 /mL， randomly divided into five groups： control group， VAN group， low dose group of TSⅡA Sulfonate Injection， middle dose group of TSⅡA Sulfonate Injection， hight dose group of TSⅡA Sulfonate Injection. Except for the control group adding PBS， other groups were added 100 μg/L VAN for 24 hours. Then， the control group and VAN group were respectively added to the same volume of PBS， and the high dose group， middle dose group and low dose group of TSⅡA respectively added to different concentrations of TSⅡA. The cell viability was detected with MTT method， the activity of LDH were measured and the cell viability was detected with the content of LDH. DCFH-DA was used as the fluorescence probe to detect the level of ROS by a fluorescence microplate reader. Annexin V-FITC/PI double dyeing method was used to detect apoptosis rate. Results Compared with the control group， the survival rate of the cells and the activity of CAT were decreased， meanwhile the level of ROS， the activity of LDH and apoptosis rate were increased in the VAN group （P < 0.05）. Compared with the VAN group， the survival rate of the cells and the activity of CAT were increased， meanwhile the level of ROS， the activity of LDH and apoptosis rate were decreased in the low， middle and hight dose group of TSⅡA Sulfonate Injection （P < 0.05）， and there was a concentration dependence. Conclusion TSⅡA Sulfonate Injection can promote the proliferation of HK-2 cells in vitro， and improve the biochemical parameters and enzyme levels. The results suggest that TSⅡA Sulfonate Injection has a protective effect on HK-2 cell， and the protective mechanisms may be related with its antioxidant effect.

[Key words] Vancomycin； TanshinoneⅡA； Cell apoptosis； Mechanism； HK-2 cell

萬古霉素（Vancomycin，VAN）是一種糖肽類抗生素，通過阻礙細菌細胞壁的合成而具有強大的抗菌作用，是治療革蘭陽性菌感染的主要藥物，臨床主要用于耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染[1-2]。該藥具有一定的腎毒性、耳毒性，個體差異較大，且治療指數小[3-4]，腎毒性是其劑量限值性毒性，目前臨床多采用調整給藥劑量和監測血藥濃度的方法來減少VAN腎損害[5]，但即使嚴格按照肌酐清除率給藥和監測血藥濃度，仍有很多患者發生腎功能損傷，并不能使每一位患者獲益。丹參酮Ⅱ-A（tanshinon Ⅱ-A，TSⅡA）是唇形科植物丹參的脂溶性主要有效成分之一[6]，其具有抗炎抑菌[7]、清除自由基與抗氧化作用[8]、保肝及改善肝功能、抗癌、改善血循環等藥理作用[9]，研究表明，其對各種類型的急慢性腎衰竭具有保護作用[10-12]。本研究擬以HK-2細胞為研究模型，研究丹參酮ⅡA對VAN損傷的HK-2氧化指標和細胞凋亡的影響，并探討其可能機制，以確定TSⅡA對VAN腎損傷的療效，為開發TSⅡA新的藥理作用及臨床應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 儀器

721型分光光度計（上海分析儀器總廠）；2323-2型水套式二氧化碳培養箱（美國Shellab公司），EPICS X2型流式細胞儀（美國Beckman Coulter公司），BIORAD550型酶聯免疫測定儀（美國BIO-RAD公司）。

1.2 藥品與試劑

注射用萬古霉素（禮來蘇州制藥有限公司，批號：C467438，規格：每支500 mg）；TSⅡA磺酸鈉注射液（上海第一生化藥業有限公司，批號：1503022，規格：10 mg/5 mL）；細胞培養新生小牛血清（美國Hyclone公司，批號：DQAO194），DMEM培養基（美國Hyclone公司，批號：1177845）；四甲基偶氮唑藍MTT（美國Sigma公司，批號：M2128）；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒（凱基生物）；DCFH.DAROS檢測試劑盒（杭州碧云天公司。批號：20160802）；乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20160723）。

1.3 HK-2細胞培養

人腎小管上皮（HK-2）細胞由廣西醫科大學中心實驗室提供，培養條件：5% CO2培養箱，pH 7.4，37℃，10%新生牛血清，DMEM培養液。根據生長狀況每2～3天消化換液傳代培養，取處于對數生長期的細胞用于實驗研究。

1.4 實驗分組

取上述培養的處于對數期的HK-2細胞（細胞數約為1×106個/mL），接種于6孔培養板，分為空白組、VAN組、TSⅡAL組、TSⅡAM組、TSⅡAH組，除空白組外其他各組均加入含終濃度為100 μg/L VAN培養液制造VAN損傷模型，培養24 h后，空白組和模型組加入20 μl的PBS溶液，TSⅡAL組、TSⅡAM組、TSⅡAH組分別加入15、30、60 μg/mL的TSⅡA 20 μL繼續培養。每組設6個復孔。

1.5顯微鏡下觀察細胞形態學變化

按上述“1.4”方法繼續處理48 h后，棄上層培養液，PBS沖洗3～5次，加入正常培養液約10 mL，光學顯微鏡觀察細胞輪廓形態。

1.6 MTT法測定細胞存活率

按上述“1.4”方法繼續處理24 h及48 h，按MTT法操作流程和步驟測定細胞存活率。紫外分光光度計下測定吸光度（A）值，檢測條件為：檢測波長490 nm，參比波長630 nm，結果以存活率表示，計算公式為存活率=（A實驗組/A空白組）×100%。每次實驗平行監測2塊板，重復3次[13-14]。

1.7 比色法測定細胞懸液中的LDH、CAT活性

按上述“1.4”方法分組和處理24 h，加細胞裂解液裂解，3000 r/min離心10 min（離心半徑為60 cm），棄上清液，按試劑盒測LDH、CAT含量。LDH、CAT活性均采用比色法，每次實驗平行檢測2塊板，重復3次。

1.8 熒光素DCFH-DA探針法測定細胞內ROS含量

按上述“1.4”方法分組，置于培養箱中培養24 h，參照ROS劑盒說明書，裝載DCFH-DA探針，培養箱中培養20 min后予PBS緩沖液洗滌細胞5次，除盡游離的DCFH-DA，多功能酶標儀檢測細胞內ROS含量，檢測條件：激發波長488 nm，發射波長525 nm。結果以比值表示，計算公式為ROS含量比值=實驗組A值/空白組A值[13-14]。每次實驗平行監測2塊板，重復3次。

1.9 Annexin V- FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡率

按上述“1.4”方法分組處理48 h，經胰酶消化后離心，并以PBS 3～5次清洗重懸，去除培養基。按照細胞凋亡實驗操作，在Binding Buffer懸浮細胞后加入5 μL Annexin-FITC振動30 s混勻，加入5 μL PI室溫避光條件下反應15 min，取反應液上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.10 統計學方法

應用SPSS 13.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TSⅡA對VAN損傷HK-2細胞形態學的影響

實驗結果顯示，高倍光學顯微鏡下，空白組細胞形態為不規則的島嶼狀，細胞布滿整個板區，可見梭狀細胞融合成片，并見多處復層生長：VAN組細胞明顯萎縮，成不規則狀，鏡下細胞數量明顯減少；TSⅡAL、TSⅡAM、TSⅡAH組細胞數量均有不同程度增加，但仍明顯少于空白組。見圖1（封四）。

2.2 TSⅡA對VAN損傷HK-2細胞存活率的影響

存活率實驗顯示，VAN造模處理后，HK-2細胞存活率均顯著降低，且隨著時間延長存活率進一步降低，且具有時間效應，差異有統計學意義（P < 0.05）；與VAN組比較，TSⅡA各組細胞存活率均出現不同程度的升高，TSⅡA L、TSⅡA M、TSⅡA H劑量組隨著TSⅡA濃度的增加，存活率逐漸增加，具有一定濃度效應，差異有統計學意義（P < 0.05）。見表1。

2.3 TSⅡA對VAN損傷HK-2細胞懸液中LDH、CAT活性的影響

實驗結果顯示，VAN損傷后，各組LDH活性均顯著增高，CAT活性均顯著降低，VAN組LDH活性比空白組高出近4倍，CAT活性比空白組降低近1/2，差異有統計學意義（P < 0.05）。給予TSⅡA干預后，TSⅡA各劑量組LDH均有不同程度降低，CAT有不同程度升高，改善程度具有濃度效應，差異均有統計學意義（P < 0.05）。見表2。

2.4 TSⅡA對VAN損傷HK-2細胞內ROS水平的影響

實驗結果顯示，與空白組比較，VAN組細胞內ROS水平顯著升高，且數值上升近2倍，差異有統計學意義（P < 0.05）。與VAN組比較，TSⅡA各劑量組細胞內ROS水平出現不同程度下降，且隨著TSⅡA濃度的增加，下降作用更明顯，表現出一定的濃度效應，差異有統計學意義（P < 0.05）。見圖2。

2.5 TSⅡA對VAN損傷HK-2細胞凋亡率的影響

Annexin V-FITC/PI雙染結果顯示，VAN作用于HK-2細胞48 h后，細胞的凋亡率為89.6%，較空白組明顯增加，TSⅡAL組、TSⅡAM組、TSⅡAH組分別為79.3%，65.6%，58.1%，較模型組顯著降低（P < 0.05），且具有濃度效應。見圖3。

3 討論

研究發現，VAN進入體內后，可導致體內生成過多的活性氧自由基，氧自由基是細胞膜脂質過氧化、蛋白質變性甚至是DNA損傷的重要原因，最終通過一系列的反應導致腎臟細胞損傷[15-16]。故此，研究者進一步深入研究了一些具有抗氧化作用的藥物對VAN腎損傷的保護作用。Ocak等[17]研究發現在維生素E、維生素C、N-乙酰半胱氨酸、咖啡酸苯乙酯聯用VAN治療過程中，維生素E對VAN腎毒性的保護效應最強。研究表明，丹參酮ⅡA能有效抑制細胞內過氧化產物對DNA的損傷，其保護作用可能是通過清除細胞內氧自由基，從而阻斷脂質過氧化的鏈式反應，進而抑制DNA加成物的生成以減少細胞毒性[18-20]。

本研究結果顯示，TSⅡA能有效地增加VAN損傷的HK-2細胞的生存率，明顯降低VAN損傷細胞LDH活性和細胞內ROS水平，并提高細胞懸液中CAT活性，且作用表現出一定的濃度效應。表明TSⅡA有效地減低了VAN損傷HK-2細胞內的氧化反應。細胞凋亡結果顯示TSⅡA有效降低VAN誘導HK-2細胞的凋亡率，且在實驗設計的度范圍內具有劑量依賴性。由此可推斷TSⅡA可能通過降低HK-2細胞內氧化反應，從而減輕細胞凋亡，從而對VAN損傷的HK-2細胞起到保護作用。本課題組前期研究還證實TSⅡA磺酸鈉注射液能有效的降低VAN損傷大鼠體內的氧化應激反應，改善損傷大鼠的腎功能，減輕腎臟的病理變化，對VAN損傷大鼠氧化指標和腎功能均具有改善作用[11]。結合本實驗研究結果和前期研究結果，可推斷氧化應激反應是VAN腎損傷的可能機制，而TSⅡA則可通過清除細胞的氧自由基以及提高自由基清除酶的活性，而減少細胞氧化損害，延緩腎臟毒性的發展進程，從而起到保護VAN損傷的作用。

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（收稿日期：2018-01-15 本文編輯：李岳澤）