HPLC法同時測定粉防己中漢防己甲素和漢防己乙素的含量

宋俊蓉 婁華勇 方友來 藍俊杰 何敏 馬小攀 潘衛東

摘 要：基于更好的完善粉防己的質量控制標準，以提取時間、方法、溶劑比為主要影響因素，考察了不同提取方法對粉防己中漢防己甲、乙素提取率的影響，建立了一種同時測定粉防己中漢防己甲素和漢防己乙素的高效液相色譜分析方法。色譜條件為：Hypersil GOLD Phenyi柱（250 mm × 4.6 mm， 5 μm），甲醇- 0.1% 三乙胺 （85∶15），檢測波長為228 nm，進樣量10μL，柱溫30℃，流速1 mL/min。樣品中漢防己甲素在0.12～2.31 μg范圍內呈良好的線性關系，平均加樣回收率分別為102.80%、104.46%、103.49%，RSD分別為1.72%、0.38%、1.39%；漢防己乙素在0.05～1.09 μg范圍內呈良好的線性關系，平均加樣回收率分別為101.00%、100.08%、100.00%，RSD分別為0.40%、1.82%、1.83%。結果表明江西的粉防己中漢防己甲素和漢防己乙素含量高于其他產地。上述測定方法操作便捷、重現性好、結果可靠。

關鍵詞：高效液相色譜法；粉防己；漢防己甲素；漢防己乙素；同時測定

中圖分類號：O656.22

文獻標識碼：A

文章編號：1008-0457（2018）03-0079-05 國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2018.03.014

Simultaneous Determination of Tetrandrine and Fangchinoline from Stephania tetrandra by HPLC

SONG Junrong1，2， LOU Huayong2， FANG Youlai1，2， LAN Junjie1，2， HE Min2， MA Xiaopan3， PAN Weidong2*

（1. School of Pharmaceutical Sciences， Guizhou University， Guiyang， Guizhou 550002， China； 2. State Key Laboratory of Functions and Applications of Medicinal Plants， Guizhou Medical University， Guiyang， Guizhou 550014， China； 3. Zunyi Medical University， Zunyi， Guizhou 563000， China）

Abstract： In order to Improve the quality control standard of Stephania tetrandra， establish a high performance liquid chromatography （HPLC） method for simultaneously determination the content of Tetrandrine and Fangchinoline in S. tetrandra，was established. The effects of different extraction methods， the extraction time， method， and solvent ratio in particular， on the extraction rate of Tetrandrine and Fangchinoline were investigated. The conditions of HPLC were as below： Hypersil GOLD Phenyi column （250 mm ×4.6 mm， 5μm）， and a mobile phase consisted of methanol and 0.1% triethylamine （85∶15） by gradient elution at a flow rate of 1 mL/min. The detection wavelength was 228 nm and sample volume was 10 μL. The sample showed a good linear relationship with tetrandrine in the range of 0.12～2.31 μg. The mean sample recovery was 102.80%， 104.46%， and 103.49%， respectively， and the RSD was 1.72%， 0.38%， and 1.39%， respectively. The sample showed a linear relationship with Fangchinoline in the range of 0.05～1.09 μg. The average sample recovery rate was 101.00%， 99.08%， and 100.00%， respectively. The RSD was 0.40%， 1.8% and 0.40%， respectively. The above HPLC conditions were used to determine the contents of tetrandrine and Fangchinoline in S. tetrandra of different origins. The results showed that the contents of tetrandrine and Fangchinoline in S. tetrandra from Jiangxi Province were higher than those from other origins. The method described in the present study appears to be convenient， reproducible and reliable.

Key words：HPLC； Stephania tetrandra； tetrandrine； fangchinoline； simultaneous determination

粉防己（Stephania tetrandra S.Moore），又名漢防己、土防己、石蟾蜍、豬大腸等，為防己科植物千金藤屬植物粉防己的干燥塊根[1]，味苦辛，性寒，歸膀胱、肺經，具有解熱鎮痛、利水消腫，祛風止痛等功效[2]，用于水腫腳氣、小便不利、風濕痹痛、濕疹瘡毒、高血壓等癥的治療。粉防己中生物堿含量占總含量的1.5%～2.3% [3]，以雙芐基異喹啉類生物堿為主 [4]，主要為漢防己甲素（Tetrandrine， 簡稱Tet）和漢防己乙素（Fangchinoline，簡稱Fan）。現代藥理學證明粉防己中的生物堿具有良好的生物活性，在抗肝纖維化、拮抗Ca2+治療高血壓、誘導腫瘤細胞凋亡等方面都有較好的效果[5-6]，漢防己乙素亦可誘導肝癌細胞的自噬性死亡[7]。從粉防己藥材中提取、分離、純化出來的雙芐基異喹啉生物堿漢防己甲素已應用于臨床。

目前，粉防己藥材的獲取方式主要以采挖野生為主，由于野生植物資源日益萎縮，所以野生粉防己不能滿足市場需求，且人工種植粉防己周期長、品質差，致使市場上粉防己品質參差不齊、偽品眾多，而其常規的質控方法又不能滿足要求[8]。因此，快速測定粉防己中漢防己甲素、漢防己乙素含量的方法亟待建立。

常規的測定粉防己中漢防己甲素和漢防己乙素的方法有薄層掃描法[9]、薄層色譜法和高效液相色譜法[10-12]，其中，薄層掃描法較復雜，而薄層色譜法無法定量，且經常用到有毒溶劑。高效液相色譜（high performance liquid chromatogram，HPLC）法因處理樣品簡單、快速，且能同時測定幾種成分而被廣泛應用于各類化合物的檢測。2015版《中國藥典》采用HPLC法檢測漢防己甲素和漢防己乙素的含量，以乙腈-甲醇-水-冰醋酸（40∶30∶30∶1）（每100 ml含十二烷基磺酸鈉0.41 g）為流動相 [13]，其流動相組成較為復雜，溶劑消耗較大，迄今為止，同時測定漢防己甲素和漢防己乙素的HPLC方法還未被中國藥典收錄。鑒于此，本文建立了一種同時測定粉防己藥材中漢防己甲素和漢防己乙素含量的HPLC方法，該法簡便、快速，且流動相組成較為簡單，容易配制，溶劑消耗較少，為完善粉防己藥材的質量控制方法提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Agilent高效液相色譜系統（G1311A泵、G1315A DVD檢測器、Agilent色譜工作站）（1100，American），HP紫外分光光度測定儀（HP-1200，American），SG5200H超聲波清洗儀，梅特勒-托利多AL204電子天平，Buchi旋轉蒸發儀（B-480，Swiss）。甲醇為色譜純，二乙胺、三乙胺為分析純，三級水為Merck Millipore純水儀自制，對照品漢防己甲素購于南京景竹生物科技有限公司（JZ20150720），漢防己乙素購于成都瑞芬恩生物科技有限公司（F-006-130421），樣品粉防己購于多個中藥材市場，經貴陽中醫學院陳德媛教授鑒定為粉防己（Stephania tetrandra S.Moore）的根。

1.2 方法

1.2.1 提取方法優選

將干燥粉防己根粉碎，過3號篩，準確稱取8份粉防己藥材粉末樣品各1 g，分別置于100 mL的具塞錐形瓶中，密塞，分別加入100%、90%、85%、80%、70%甲醇溶液，20%、10%、5%氨水甲醇系列溶液作為提取溶劑進行超聲（功率300W，頻率40kHz，1 h）及回流提?。? h），過濾，濾渣重復提取3次，合并濾液減壓蒸干，備用。優選出最佳提取溶劑及提取方法后，準確稱取4份粉防己藥材粉末樣品各1 g，分別置于100 mL的具塞錐形瓶中，密塞，加入85%甲醇溶液，分別超聲提取15 min、30 min、60 min和90 min（功率300W），考察提取時間對漢防己甲素、漢防己乙素含量的影響。

1.2.2 供試品溶液的制備

準確稱取干燥的粉防己藥材粉末（過3號篩）1 g，置于100 mL的具塞錐形瓶中，密塞，加入50 mL 85%甲醇超聲30 min，過濾，濾渣超聲30 min，合并濾液減壓蒸干，加入適量85%甲醇溶解，定容至50 mL的容量瓶中。用0.45 μm的有機微孔濾膜過濾，棄去初濾液，即為供試品溶液。

1.2.3 對照品溶液的制備

分別準確稱取經P2O5干燥的漢防己甲素對照品5.78 mg、漢防己乙素對照品2.72 mg，用85%甲醇溶解，定容于50 mL的容量瓶中。配制成漢防己甲素濃度為115.6 μg/mL，漢防己乙素的濃度為54.4 μg/mL的混合對照品溶液，備用。

1.2.4 陰性對照溶液的制備

以85%甲醇作為空白溶液。

1.2.5 色譜條件

測定波長選擇：通過對陽性對照品在波長為200～400 nm范圍內進行掃描，選取檢測波長。

流動相選擇：分別考察了乙腈-甲醇-水-冰醋酸（40∶30∶30∶1）（每100 ml含十二烷基磺酸鈉0.41g）、甲醇-0.2 mol/L乙酸銨-0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.1%三乙胺（85∶15）、乙腈-0.1%三乙胺（85∶15）、甲醇-0.1%二乙胺（85∶15）、乙腈-0.1%二乙胺（85∶15） 6種流動相體系。

1.2.6 線性關系

精密吸取混合對照品溶液1、2、5、10、15、20μL，按已優化的色譜條件，注入高效液相色譜儀中，重復測定3次，對其色譜峰面積進行積分，制備標準曲線，得出回歸方程。

1.2.7 方法學考察

專屬性：分別吸取混合對照品溶液、供試品溶液、陰性溶液各10μL，按已優化的色譜條件下進樣分析。

精密度試驗：精密吸取混合對照品溶液10 μL，按已優化的色譜條件，注入高效液相色譜儀中，平行測定6次，記錄其峰面積，計算其RSD值。

穩定性考察：取同一供試品溶液，在室溫中放置，分別于0、1、2、4、8、12、24 h取10 μL按已優化色譜條件測定其峰面積，計算其RSD值。

重復性試驗：取同一批藥材粉防己5份，準確稱取1 g，按“1.2.2”方法制備，按已優化的色譜條件下注入高效液相色譜儀中，測定其峰面積，計算其RSD值。

加樣回收率試驗：精密稱取漢防己甲素、乙素對照品適量置于10 mL容量瓶中，用85%甲醇溶解并定容， 搖勻，配制成漢防己甲素的濃度為3.100 μg/mL，漢防己乙素為0.658 μg/mL。精密稱定已知含量的粉防己粉末0.5000 g，再分別加入已制備好的對照品溶液1.2、1.0、0.8 mL，制成高、中、低濃度的加樣回收實驗。吸取10μL，按已優化的色譜條件下注入高效液相色譜儀中，記錄其峰面積，計算回收率及其RSD值。

1.2.7 含量測定

分別取產地為江西吉安、江西宜春、湖北黃石、安徽銅陵、安徽蕪湖的粉防己藥材打粉，準確稱定粉防己粉末約1 g，按“1.2.2”供試品溶液方法制備，分別吸取10 μL進樣，按已優化的色譜條件注入高效液相色譜儀，重復測定3次，外標法計算漢防己甲素和漢防己乙素的含量。

2 結果與分析

2.1 提取方法、溶劑及時間的優化

不同提取方法、不同提取溶劑對粉防己中漢防己甲、乙素提取率的影響如表1、2所示。表1結果表明，超聲波提取法的不同溶劑漢防己甲、乙素的提出率均高于連續回流法，隨著甲醇體積分數的增加，粉防己中漢防己甲、乙素的得率均呈上升趨勢，當甲醇體積分數為85%時，漢防己甲、乙素得率均最高，分別為2.589%和1.129%，明顯高于純甲醇提取和甲醇氨水混合溶劑，故選取體積分數為85%的甲醇溶液作為最佳提取溶劑。說明在此溶液體系下，漢防己甲、乙素在85%甲醇溶液中的溶出度最高。因為當甲醇濃度升高時，溶入有機溶劑的漢防己甲、乙素的量也越多，但當濃度升高至超過最適濃度時，漢防己甲、乙素的溶出度反而降低，從而影響了甲、乙素的提取率，使得提取率隨著濃度的升高而下降。同時，由表1 可知，超聲提取所得漢防己甲、乙素的提取率高于回流提取法。因為超聲波具有空化效應、機械效應及熱效應的特點，這些作用增大了介質分子的運動速度，提高了介質的穿透能力，促進了藥物有效成分的溶解及擴散，提高溶出效率。故此選擇超聲提取法為最佳提取方法。

不同提取時間對漢防己甲、乙素提取率影響結果見表2，由表知，超聲提取15 min后漢防己甲、乙素提取率分別為2.516%，1.109%，超聲提取30 min后漢防己甲、乙素提取率分別為2.589%，1.129%，分別相差 0.073%、0.020%。超聲提取60 min后漢防己甲、乙素提取率分別為2.593%，1.135%，與30 min相比分別相差 0.004%、0.006%。超聲提取90 min后漢防己甲、乙素提取率分別為2.596%，1.138%，與30 min相比分別相差 0.007%、0.009%。由此可以看出，超聲時間越長提取率越高。其中，超聲30 min與超聲60 min，90 min所得提取率差別不大，考慮到節約時間，故選擇超聲提取時間為30 min。

2.2 色譜條件

檢測波長：通過對陽性對照品在波長為200 400 nm范圍內進行掃描，發現漢防己甲素的最大吸收波長為282 nm，而漢防己乙素的最大吸收波長為228 nm和215 nm處有吸收；又將混合對照品溶液進行相同條件掃描，發現兩者的最大吸收波長為228 nm，綜合考慮基線平穩，色譜峰峰形，最大吸收等因素，故選擇228 nm作為檢測波長。

流動相：通過對6種流動相進行考察，結果表明，甲醇-0.1%的三乙胺（85∶15）作為流動相時所得峰形較好，沒有拖尾現象，分離效果也較理想，與藥典中采用常規HPLC相比分析時間明顯縮短，且藥材中其他色譜峰不干擾樣品的測定，本試驗所采用的流動相條件與藥典所提供的條件相比較更為簡單，容易配制。

色譜柱：由于SinoChrom C8和BDS Hypersil C18色譜柱拖尾較為嚴重，實驗結果都不理想。故本研究選用Thermo， Hypersil GOLD Phenyi的色譜柱，該類型色譜柱具有耐酸、耐堿，峰形、分離度較好，穩定性高等優點。

綜上所述，色譜條件為：Hypersil GOLD Phenyi柱， （250 mm × 4.6 mm， 5 μm），甲醇- 0.1% 三乙胺（85∶15），檢測波長為228 nm，進樣量10μl，柱溫30℃，流速1 mL/min。

2.3 線性分析

以色譜峰面積A為縱坐標，對照品進樣量（μg）為橫坐標，制備標準曲線，得回歸方程分別為：漢防己甲素：Y=2951.9X-29.297（r=0.9999）；漢防己乙素：Y=5509.9X+43.226（r=0.9997）。結果表明，漢防己甲素和漢防己乙素分別在0.12～2.31 μg和0.05～1.09 μg范圍內與峰面積之間呈良好的線性關系。

2.4 方法學考察

2.4.1 專屬性考察

從圖1可知，漢防己甲素和漢防己乙素在此條件下可實現較好的分離，且陰性對照無干擾，表明該方法專屬性良好。同時，出峰時間較短，表明該方法較為快捷，溶劑消耗比較少。

2.4.2 精密度試驗 由峰面積計算出漢防己甲素和漢防己乙素的RSD值分別為0.82%和0.31%。表明儀器精密度良好。

2.4.3 穩定性考察 由峰面積計算出漢防己甲素和漢防己乙素的RSD值分別為0.83%和0.80%，結果表明供試品溶液在24h內穩定。

2.4.4 重復性試驗 由峰面積計算出漢防己甲素和漢防己乙素的RSD值分別為0.74%和0.98%，結果表明漢防己甲素和漢防己乙素的重復性較好。

2.4.5 加樣回收率試驗 所得回收率、平均回收率、RSD結果見表3和表4。

2.4 含量測定

不同產地粉防己中漢防己甲、乙素含量測定見表5，江西吉安的漢防己甲素含量最高，為2.654%，安徽銅陵的含量最低，為1.764%，江西宜春的漢防己乙素含量最高，為1.731%，安徽銅陵的含量最低，為1.604%。，江西的粉防己中漢防己甲素和漢防己乙素含量高于其他產地。

3 結論與討論

通過對不同提取方法、提取時間及提取溶劑的優化選擇，以及對不同流動相、不同色譜柱等方法和條件的實驗摸索和驗證，確定了高效、經濟的HPLC色譜條件來同時測定生藥粉防己中漢防己甲素和漢防己乙素含量的方法，即：用85%甲醇超聲提取30 min，以甲醇- 0.1%三乙胺（85∶15） 為流動相，色譜柱為Thermo， Hypersil GOLD Phenyi， Dim.（250×4.6 mm）， 檢測波長為228 nm，進樣量10 μL，柱溫30℃，流速1 mL/min。利用上述HPLC條件測定了不同產地粉防己中漢防己甲素和漢防己乙素的含量，結果表明江西的粉防己中漢防己甲素和漢防己乙素含量高于其他產地。從實驗結果可知，該方法操作便捷、重現性好、專屬性強，精密度、重復性、穩定性良好，適合用于漢防己甲素和漢防己乙素的含量測定。

參 考 文 獻：

[1] 陳修園.神農本草經讀[M].北京：學苑出版社，2012：74.

[2] 黃麗萍，左 堅，張 穎.不同產地粉防己藥材中主要生物堿含量對比研究[J].甘肅中醫學院學報，2010，10（3）：65-67.

[3] 邊 城， 龐統英， 戴素美， 等.漢防己甲素抗肝纖維化作用研究[J].山東醫藥，2004，44（34）：24-25.

[4] 崔文峰， 鮑 玲， 周 英，等.一種提取粉防己堿的新方法[J].天然產物研究與開發，2008，20（4）：701-703.

[5] 李行諾， 果德安.粉防己生物堿化學成分的分離與鑒定[J].沈陽藥科大學學報，2009，26（6）：430-433.