響應面法優化酪蛋白酸鈉—豌豆分離蛋白納米乳液制備工藝

李靜紅

(中國農業科技開發中心，北京　100000)

豌豆分離蛋白(Pea protein isolated，PPI)的必需氨基酸組成均衡，與FAO/WHO推薦標準模式較為接近[1-4]，但由于其功能性質與大豆蛋白相比較差，從而未在食品加工與利用中得到充分應用[5]。酪蛋白酸鈉(SC)是酪蛋白的鈉鹽形式，具有較高的乳化性和增稠性[6]，因此，可以將SC與PPI復合，從而改善PPI的功能特性。Yerramilli等[7]通過將PPI和SC等比例混合后采用高壓均質處理制成PPI-SC納米乳液，結果發現，該納米乳液具有較好的儲藏穩定性。Ji等[8]通過將酪蛋白酸鈉與大豆分離蛋白以1∶1的比例混合制備成5%的O/W乳液，結果發現，混合乳液的穩定性比單獨蛋白質乳液好。超聲波是一種具有空化作用的處理技術[9-11]，目前，鮮有將超聲處理用于制備PPI-SC納米乳液的研究。鑒于此，本文以PPI和SC為乳化相，通過響應面法優化超聲處理制備PPI-SC納米乳液的工藝，以獲得具有較好穩定性的納米乳液。

1　材料與方法

1.1　材料與儀器

姜黃素，美國Sigma公司；豌豆分離蛋白(PPI)，山東禹王實業有限公司；酪蛋白酸鈉(SC)，澳大利亞Murray Goulburn公司；中鏈甘油三酯(MCT)，美國Sigma公司；其他試劑，均為國產分析純。

Ultra-Turrax T25高速分散器，德國IKA；Zetasizer Nano-ZS90光散射粒徑分析儀，英國Malvern；UV2600紫外可見分光光度計，日本島津；Turbiscan Lab Expert濃縮體系穩定性分析儀，法國 Formulaction；JY92-2D型超聲波細胞破碎儀，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2　試驗方法

1.2.1PPI-SC納米乳液制備工藝將一定質量的PPI和SC溶于磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.0)中制成水相。另取一定質量的姜黃素溶于MCT中制成油相，采用磁力攪拌器攪拌直至姜黃素完全溶解，最終油相中姜黃素的濃度為1%(w/w)。將水相與油相以9∶1的比例混合，采用高速分散器在18 000r/min下處理6min得到粗乳液。取適量粗乳液置于燒杯中，采用超聲波細胞破碎儀進行處理(參數見1.2.5)后得到SC-PPI納米乳液。

1.2.2PPI-SC納米乳液平均粒徑及ζ電位測定采用Zetasizer Nano-ZS 90 光散射粒度分析儀對SC-PPI納米乳液的平均粒徑及ζ電位進行測定，油滴的折射率設置為1.45，水相溶液折射率設置為1.33。為了降低多重光散射效應，測定前將納米乳液稀釋1 000倍后測定平均粒徑及PDI，稀釋50倍后測定ζ電位。

1.2.3TSI分析參考Yuan等[12]的方法，利用 Turbiscan Lab Expert 濃縮體系穩定性分析儀對SC-PPI納米乳液的穩定性進行分析。測定過程如下：取18mL PPI-SC納米乳液于儀器專用圓柱形的玻璃杯中，55℃下掃描6 h，掃描間隔為30min，記錄TSI。

1.2.4乳化產率測定參考段雪芹[13]的方法，采用HPLC測定納米乳液中姜黃素的含量。色譜條件為：C18色譜柱(5μm，4.6mm×150mm)，流動相為乙腈—水(50%∶50%)，流速為0.9mL/min，樣品進樣量為10μL，檢測波長為425 nm。借助Dionex Chromeleon軟件處理數據，從而確定姜黃素在PPI-SC納米乳液中的含量，并通過式(1)計算PPI-PC納米乳液的乳化產率：

(1)

1.2.5單因素試驗

(1)PPI添加量：分別配制PPI添加量為2%、3%、4%、5%、6%(w/v)、SC添加量為4%(w/v)的水相。將水相與油相以9∶1的比例混合，并用高速分散器在18 000r/min下分散6min，獲得粗乳液。采用超聲波細胞破碎儀將粗乳液在20KHz、輸出功率400W下處理5min(超聲時間4s、間隔時間4s)制得PPI-SC納米乳液，測定其平均粒徑、PDI及乳化產率。

(2)SC添加量：分別配制PPI添加量為4%(w/v)，SC添加量為3.5%、3.75%、4%、4.25%、4.5%(w/v)的水相。將水相與油相以9∶1的比例混合，并用高速分散器在18 000 r/min下分散6min，獲得粗乳液。采用超聲波細胞破碎儀將粗乳液在20 KHz、輸出功率400W下處理5min(超聲時間4 s、間隔時間4 s)制得PPI-SC納米乳液，測定其平均粒徑、PDI及乳化產率。

(3)超聲功率：配制PPI添加量為4%(w/v)、SC添加量為4%(w/v)水相。將水相與油相以9∶1的比例混合，并用高速分散器在18 000r/min下分散6min，獲得粗乳液。采用超聲波細胞破碎儀將粗乳液在20KHz，輸出功率分別為200、300、400、500、600W下處理5min(超聲時間4 s、間隔時間4 s)制得PPI-SC納米乳液，測定其平均粒徑、PDI及乳化產率。

1.2.6Box-Benhnken中心組合試驗設計根據單因素試驗結果，選取PPI添加量(%)、SC添加量B(%)及超聲功率C(W)3個因素為自變量，以平均粒徑、TSI值及乳化產率為響應值，利用Design-Expert軟件進行響應面分析設計優化，從而確定超聲處理制備PPI-SC納米乳液的最佳工藝(表1)。

表1　試驗因素及編碼

1.3　數據處理

每組試驗都進行3次平行試驗。采用SPSS 20對數據進行差異顯著性分析，P<0.05為顯著性差異；采用Design-Expert進行響應面分析設計優化實驗結果。

2　結果與分析

2.1　單因素試驗

2.1.1PPI添加量控制SC添加量為4%(w/v)、超聲功率400W，調控PPI添加量分別為2 %、3 %、4 %、5 %、6 %(w/v)，考察PPI添加量對PPI-SC納米乳液平均粒徑、ζ電位、PDI、濁度及乳化產率的影響規律。由表2可知，PPI-SC納米乳液的平均粒徑數值隨著PPI添加量的增加先下降后上升，這可能是由于當PPI添加量較低時，PPI分子間可聚集生成膠束體系，而隨著PPI添加量的增加，其界面蛋白濃度達到臨界值，不會再吸附更多的PPI，當PPI添加量過高時，未在連續相界面吸附的PPI分子會因滲透聚集作用而產生液滴絮凝[14]。Donsi等[15]利用添加量為4%(w/v)的豌豆分離蛋白在高壓均質處理下成功制備了穩定的納米乳液。PDI是反應乳液穩定性的重要參數，其數值越小，說明乳液顆粒分布越集中。而TSI數值越小，ζ電位絕對值越大，表明乳液越穩定。由表2中PDI、TSI和ζ電位絕對值可知，PPI添加量為4%(w/v)時，SC-PPI納米乳液的顆粒分布集中，穩定性最好。且在此PPI添加量下，納米乳液的平均粒徑最小。由此確定，SC-PPI納米乳液制備工藝最優的PPI添加量為4%(w/v)。

表2　PPI添加量對納米乳液性質的影響

2.1.2SC添加量由表3可知，SC-PPI納米乳液的平均粒徑和PDI值隨著SC添加量的增加而逐漸上升，當SC添加量為4%(w/v)時，達到最小值，之后逐漸增高。當SC添加量逐漸升至4%(w/v)時，SC與未完全吸附于連續相的PPI作用，進而降低因蛋白質聚集體而產生的油滴絮凝，從而使SC-PPI納米乳液的平均粒徑和PDI值下降。而隨著SC添加量的增加，納米乳液的平均粒徑和PDI值逐漸下降，這有可能是由于過量的SC代替PPI進入連續相，從而降低界面蛋白含量，乳液粒徑增大。而ζ電位絕對值和TSI值的變化趨勢進一步驗證了這一可能性。因此，為制備性質穩定的SC-PPI納米乳液，確定其SC添加量為4%。

表3　SC添加量對納米乳液性質的影響

表4　超聲功率對納米乳液性質的影響

2.2　響應面法分析

以PPI添加量A(%)、SC添加量B(%)、超聲功率C(W)，以PPI-SC納米乳液的平均粒徑R1(nm)、PDI R2及乳化產率R3(%)為響應值進行響應面試驗(表5)。

表5　響應面試驗設計及結果

2.2.1PPI-SC納米乳液平均粒徑響應面分析平均粒徑R1通過軟件Design-Expert進行數據分析，建立二次響應面回歸模型如式(2)：

R1=149.82-6.45A-14.06B-10.89C-7.28AB+6.93AC-9.40BC+34.87A2+41.59B2+30.74C2

(2)

式(2)中：R1為平均粒徑；A為PPI添加量；B為SC添加量；C為超聲功率(圖1)。

表6　SC-PPI納米乳液平均粒徑回歸與方差分析結果

2.2.2PPI-SC納米乳液TSI響應面分析TSI R2通過軟件Design-Expert進行數據分析，建立二次響應面回歸模型如式(3)：

R2=3.01-0.024A-0.032B-0.081C-0.015AB-0.073AC-0.045BC+0.14A2+0.082B2+0.19C2

(3)

式(3)中：R2為TSI；A為PPI添加量；B為SC添加量；C為超聲功率(圖2)。

表7　SC-PPI納米乳液TSI回歸與方差分析結果

圖1　兩因素交互作用對SC-PPI納米乳液平均粒徑的響應面

圖2　兩因素交互作用對SC-PPI納米乳液TSI的響應面

圖3　兩因素交互作用對SC-PPI納米乳液乳化產率的響應面

2.2.3PPI-SC納米乳液乳化產率響應面分析乳化產率 R3通過軟件Design-Expert進行數據分析，建立二次響應面回歸模型如式(4)：

R3=91.28+0.19A+0.71B+0.30C+0.37AB-0.74AC+0.59BC-1.81A2-1.75B2-1.53C2

(4)

式(4)中：R3為乳化產率；A為PPI添加量；B為SC添加量；C為超聲功率(圖3)。

表8　SC-PPI納米乳液乳化產率回歸與方差分析結果

2.2.4聯合求解采用Design-Expert 的聯合求解法確定平均粒徑、TSI及乳化產率均優條件為PPI添加量4.09%(w/v)、SC添加量4.06%(w/v)、超聲功率419.54W，此條件下平均粒徑為147.08 nm、TSI為2.99、乳化產率為91.37 %。為適應生產，將制備條件優化為PPI添加量4.00%(w/v)、SC添加量4.00%(w/v)、超聲功率400 W，進行3次平行實驗得到PPI-SC納米乳液平均粒徑為149.82 nm、TSI為3.008、乳化產率為91.28%。說明響應值的實驗值與回歸方程預測值吻合良好。

3　結論

在單因素試驗基礎上，利用響應面分析法優化PPI-SC納米乳液制備工藝，擬合PPI添加量、SC添加量和超聲功率3個因素，經平均粒徑、TSI和乳化產率的響應面聯合求解分析確定超聲處理制備PPI-SC納米乳液的工藝條件為PPI添加量4.09%(w/v)、SC添加量4.06%(w/v)、超聲功率419.54W。考慮到實際操作的可行性，將制備工藝調整為PPI添加量4.00%(w/v)、SC添加量4.00%(w/v)、超聲功率400W，進行3次平行試驗，3次平行驗證得到酪蛋白酸鈉—豌豆蛋白納米乳液平均粒徑為149.82nm、TSI為3.008、乳化產率為91.28%，進一步驗證本文的最佳制備工藝條件。◇