水飛薊的毒理學(xué)安全性評價(jià)

韓　超，石麗麗，趙金鵬，李　巖

(中國疾病預(yù)防控制中心營養(yǎng)與健康所，北京　100050)

水飛薊是菊科水飛薊屬的藥用植物，具有清熱解毒、疏肝利膽的傳統(tǒng)功效[1]。水飛薊的干燥果實(shí)經(jīng)提取、精制而得到的有效成分稱為水飛薊素。在歐美國家，水飛薊素作為較為經(jīng)典的保肝藥物，被廣泛應(yīng)用于各種肝損傷的治療。1972年，水飛薊引入我國作為一種保肝藥用植物推廣種植[2]。近年來，水飛薊逐漸應(yīng)用于保健食品領(lǐng)域，主要用于保護(hù)肝功能。目前國內(nèi)外對于水飛薊的研究主要集中于其功效方面，關(guān)于水飛薊的食用安全性評價(jià)報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)通過急性經(jīng)口毒性實(shí)驗(yàn)、三項(xiàng)遺傳毒性實(shí)驗(yàn)、大鼠30d喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)對水飛薊的毒性做了初步研究，為水飛薊在保健食品和醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

受試物：水飛薊膠囊的內(nèi)容物為棕黃色粉末，人體推薦量為972mg/d，即每天16.2mg/kg·BW(成人按60kg體重計(jì))。

1.2實(shí)驗(yàn)動物和飼料條件

SD大鼠(SPF級)、昆明種小鼠(SPF級)均由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，生產(chǎn)許可證號為SCXK(軍)2012—0004。動物飼養(yǎng)地點(diǎn)為中國疾病預(yù)防控制中心動物房，實(shí)驗(yàn)室為屏障環(huán)境，溫度20～24℃，相對濕度40 %～70%，許可證號為SYXK(京)2014-0043，實(shí)驗(yàn)動物實(shí)驗(yàn)前在動物房環(huán)境中適應(yīng)3d。

1.3實(shí)驗(yàn)菌株

Ames實(shí)驗(yàn)選用組氨酸營養(yǎng)缺陷型鼠傷寒沙門菌：TA97、TA98、TA100和TA102，菌株均經(jīng)過生物學(xué)鑒定合格后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1急性經(jīng)口毒性實(shí)驗(yàn)健康SD大鼠20只，雌雄各半，體重180～220g，采用最大耐受量(MTD)法。受試物給予劑量為18.0g/kg·BW，稱取受試物30.0g，加0.5%羧甲基纖維素鈉至100mL，終濃度為0.30g/mL。實(shí)驗(yàn)前動物隔夜空腹(禁食16h，不限制飲水)，以20.0mL/kg·BW灌胃量進(jìn)行灌胃，1日3次，每次間隔4h。觀察期14d，記錄動物中毒癥狀及死亡情況。

1.4.2Ames實(shí)驗(yàn)采用平板摻入法，使用鑒定合格的菌株TA97、TA98、TA100、TA102，用S9混合液作為體外代謝活化系統(tǒng)。實(shí)驗(yàn)劑量為5 000、1 000、200、40、8μg/皿。稱取受試物1.0g，以0.103 MPa、20min高壓滅菌后，加滅菌DMSO定容至20mL，濃度為50 000μg/mL，作為最高劑量濃度。并設(shè)立空白對照組、溶劑對照組和陽性對照組，陽性物包括2-氨基芴、甲基磺酸甲酯、1，8-二羥基蒽醌和敵克松，每個(gè)組分別設(shè)3個(gè)平行皿。此實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次，若受試物的回變菌落數(shù)是溶劑對照組的2倍以上，且具有劑量反應(yīng)關(guān)系者則為陽性。

1.4.3小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)選用健康昆明小鼠50只，體重25～30g，隨機(jī)分為5組，每組10只。實(shí)驗(yàn)按照一次性最大灌胃劑量方法進(jìn)行劑量設(shè)計(jì)，3個(gè)劑量組分別為1.50、3.00、6.00g/kg·BW，另設(shè)溶劑對照組和環(huán)磷酰胺陽性對照組(40mg/kg·BW)。采用間隔24 h兩次經(jīng)口灌胃法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，按20mL/kg·BW灌胃，第2次給予受試物6 h后頸椎脫臼處死動物，取胸骨骨髓制片。每只動物計(jì)數(shù)200個(gè)嗜多染紅細(xì)胞(PCE)，計(jì)算嗜多染紅細(xì)胞與成熟紅細(xì)胞的比值(PCE/NCE)；并觀察1 000個(gè)PCE中含微核的細(xì)胞數(shù)，統(tǒng)計(jì)微核發(fā)生率。

1.4.4小鼠精子畸形實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)選用健康性成熟雄性昆明小鼠30只，體重25～35g。按照一次性最大灌胃劑量方法進(jìn)行劑量設(shè)計(jì)，3個(gè)受試物劑量組分別為1.50、3.00、6.00g/kg·BW，另設(shè)溶劑對照組和環(huán)磷酰胺陽性對照組(40mg/kg·BW)。灌胃量為20mL/kg·BW，連續(xù)5d灌胃給予受試物。實(shí)驗(yàn)第35d，頸椎脫臼處死小鼠，取兩側(cè)附睪精子濾液制片、鏡檢。每只小鼠計(jì)數(shù)1 000個(gè)精子，并計(jì)算精子畸形率。

1.4.5大鼠30d喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)選用健康斷乳SD大鼠80只，設(shè)對照組和3個(gè)劑量組，每組20只，雌雄各半。根據(jù)樣品的人體推薦量設(shè)立3個(gè)劑量組，分別為0.41、0.81、1.62g/kg·BW。按大鼠每日100g體重進(jìn)食10g飼料計(jì)算，低、中、高劑量組分別取81、162、324g的受試物添加飼料至20kg。對照組給予基礎(chǔ)飼料。實(shí)驗(yàn)期間，每天觀察并記錄動物的生長狀況，每周稱1次體重，記錄每周進(jìn)食量并計(jì)算食物利用率。30d 后麻醉腹主動脈取血檢測血液學(xué)和血液生化學(xué)檢查。對每只大鼠進(jìn)行大體解剖，對肝、腎、脾和睪丸(卵巢)進(jìn)行稱重，計(jì)算臟體比。對照組和高劑量組的肝、腎、脾、胃、十二指腸和睪丸(卵巢)進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。

1.4.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用 SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，微核實(shí)驗(yàn)采用泊松分布檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)，精子畸形實(shí)驗(yàn)采用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，大鼠30d喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)采用方差分析，以α=0.05作為顯著性水平。

2　結(jié)果與分析

2.1急性毒性實(shí)驗(yàn)水飛薊以18.0g/kg·BW劑量灌胃給予大鼠，14d內(nèi)未見實(shí)驗(yàn)動物出現(xiàn)中毒癥狀和死亡情況，表明水飛薊對雌、雄兩種性別的大鼠的急性毒性最大耐受劑量均大于18.0g/kg·BW。

2.2遺傳毒性實(shí)驗(yàn)

2.2.1Ames實(shí)驗(yàn)在加S9與不加S9的情況下，各實(shí)驗(yàn)組在相同實(shí)驗(yàn)條件下重復(fù)2次實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，水飛薊各劑量組的回變菌落數(shù)都沒有超過自發(fā)回變菌落數(shù)的2倍，并且各劑量組間未出現(xiàn)明顯的劑量反應(yīng)關(guān)系。因此，水飛薊對鼠傷寒沙門氏菌TA97、TA98、TA100、TA102不具有致突變作用。

2.2.2小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)與陰性對照組相比，水飛薊各劑量組嗜多染紅細(xì)胞(PCE)與成熟紅細(xì)胞(NCE)的百分比并未低于20%，說明在此實(shí)驗(yàn)劑量下水飛薊未表現(xiàn)出細(xì)胞毒性；環(huán)磷酰胺陽性組的微核率顯著升高(P<0.01)，而各劑量組的微核率并未出現(xiàn)顯著性差異(P>0.05)，表明水飛薊對小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞未產(chǎn)生致突變作用(表1)。

2.2.3小鼠精子畸形實(shí)驗(yàn)與陰性對照組相比，水飛薊各劑量組的精子畸形率未出現(xiàn)顯著性差異(P>0.05)，而環(huán)磷酰胺陽性組與陰性對照組相比，具有顯著性差異(P<0.01)，表明水飛薊對小鼠精子無致畸作用(表2)。

2.3大鼠30d喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

2.3.1生長狀況及食物利用率實(shí)驗(yàn)期間，所有動物活動正常，無明顯中毒癥狀，生長發(fā)育良好。與對照組相比，各劑量組動物體重、增重、進(jìn)食量和食物利用率均無顯著性差異(P>0.05)(表3)。

表1　小鼠骨髓細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2　精子畸形實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3　水飛薊膠囊對大鼠體重、食物總攝入量和食物利用率的影響

表4　水飛薊膠囊對大鼠血液學(xué)的影響

2.3.2血液學(xué)指標(biāo)各劑量組大鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)┢谘簩W(xué)指標(biāo)與對照組比較，0.41、0.81g/kg·BW劑量組雌性大鼠嗜酸細(xì)胞百分比與對照組比較顯著升高(P<0.01)，0.81g/kg·BW劑量組雄性大鼠中性細(xì)胞百分比與對照組比較顯著降低(P<0.01)，但以上各指標(biāo)的差異均在本實(shí)驗(yàn)室對照組歷史正常檢測范圍內(nèi)，且劑量組之間并無劑量反應(yīng)關(guān)系，因此上述差異無生物學(xué)意義，其余各劑量組血液學(xué)檢測結(jié)果與對照組比較均無顯著性差異(P>0.05)(表4、表5)。

2.3.3血液生化指標(biāo)各劑量組大鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)┢谘荷笜?biāo)與對照組比較，0.41g/kg·BW劑量組雌性大鼠的谷丙轉(zhuǎn)氨酶顯著升高(P<0.05)，但此指標(biāo)的變化在實(shí)驗(yàn)室對照組歷史正常檢測范圍內(nèi)，該指標(biāo)的升高無生物學(xué)意義。1.62g/kg·BW劑量組雌性大鼠谷草轉(zhuǎn)氨酶明顯低于對照組(P<0.05)，該指標(biāo)的降低無生物學(xué)意義。其余各劑量組血生化檢測結(jié)果與對照組比較均無顯著性差異(P>0.05)(表6、表7)。

2.3.4對大鼠臟器重和臟體比的影響各劑量組大鼠臟器重肝、脾、腎、睪丸(卵巢)及實(shí)驗(yàn)?zāi)┛崭贵w重、臟體比肝/體、脾/體、腎/體、睪丸(卵巢)/體和陰性對照組比較均無顯著性差異。

2.3.5組織病理學(xué)檢查對照組、高劑量組各有1只動物出現(xiàn)肝細(xì)胞點(diǎn)狀壞死，此肝臟病理學(xué)改變是動物常見自發(fā)病變，并且高劑量組的病變發(fā)生率與對照組無顯著性差異，因此該病變和受試物無關(guān)。腎、脾、胃及十二指腸、睪丸和卵巢未發(fā)現(xiàn)明顯異常。因此，與對照組比較，水飛薊并未引起動物肝、腎、脾、胃及十二指腸、睪丸(卵巢)的病理學(xué)改變。

表5　水飛薊膠囊對大鼠白細(xì)胞分類的影響

表6　水飛薊膠囊對大鼠血液生化指標(biāo)的影響

表7　水飛薊膠囊對大鼠血液生化指標(biāo)的影響

3　討論

近年來，已有多項(xiàng)研究證實(shí)，水飛薊素不僅在保護(hù)肝功能方面具有良好的療效，還可以保護(hù)心肌細(xì)胞、防治糖尿病，具有降血脂、抗腫瘤等作用[3-5]。朱淑云等[6]研究發(fā)現(xiàn)，水飛薊粕對小鼠無急性毒性作用，小鼠的經(jīng)口LD50>15g/kg·BW；楊鴻武等[7]研究水飛薊膠囊的亞慢性毒性，未發(fā)現(xiàn)水飛薊膠囊具有明顯亞慢性毒性，最大未觀察到有害作用劑量為8g/kg·BW。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果與黃凰等[8]的研究結(jié)果一致，水飛薊在急性毒性、三項(xiàng)遺傳毒性和亞慢性毒性等實(shí)驗(yàn)中無明顯毒副作用。

本實(shí)驗(yàn)條件下，水飛薊對雌、雄大鼠的急性經(jīng)口最大耐受量(MTD)均大于18.0g/kg·BW。Ames實(shí)驗(yàn)、小鼠骨髓微核實(shí)驗(yàn)和精子畸形實(shí)驗(yàn)結(jié)果均未見該樣品有致突變作用。大鼠30d喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)動物活動正常，無明顯中毒癥狀，生長發(fā)育良好，各劑量組動物體重、進(jìn)食量、食物利用、血液學(xué)、血液生化學(xué)、組織病理學(xué)指標(biāo)等均未見異常。因此，在本實(shí)驗(yàn)條件下水飛薊未見明顯毒副作用，為水飛薊作為保健食品的研究開發(fā)提供了重要的毒理學(xué)科學(xué)依據(jù)。◇