超微粉碎技術對靈芝中三萜類成分溶出的影響

張福君 瞿晶田 王強

中圖分類號 R917 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）05-0599-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.05.06

摘 要 目的：研究超微粉碎技術對靈芝中三萜類成分溶出的影響。方法：采用紫外-可見分光光度法測定靈芝中三萜類成分總提取率，高效液相色譜法（HPLC）測定靈芝中9種三萜類成分（靈芝酸A、靈芝酸B、靈芝酸C、靈芝酸C1、靈芝酸C2、靈芝酸D、靈芝酸E、靈芝酸G、靈芝酸H）含量，比較30、50、80目靈芝普通粉和300目靈芝超微粉中三萜類成分總提取率及9種三萜類成分的含量。結果：30、50、80、300目靈芝粉中三萜類成分總提取率分別為（0.74±0.08）%、（0.75±0.06）%、（0.78±0.06）%、（1.09±0.10）%（RSD<2%，n=3）；隨著靈芝粉目數的增大，三萜類成分含量逐漸增大，其中300目含量最大，顯著高于靈芝普通粉（P<0.05）。結論：靈芝經超微粉碎后三萜類成分的溶出增加。

關鍵詞 靈芝；超微粉碎技術；三萜類成分；高效液相色譜法

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the effects of ultrafine grinding technology on the dissolution of triterpenoids from Ganoderma lucidum. METHODS： UV spectrophotometry was used to determine total extration rates of triterpenoids from G. lucidum. HPLC method was used to determine the contents of 9 kinds of triterpenoids （ganoderic acid A， ganoderic acid B， ganoderic acid C， ganoderic acid C1， ganoderic acid C2， ganoderic acid D， ganoderic acid E， ganoderic acid G， ganoderic acid H） from G. lucidum. The total extration rates and the contents of 9 kinds of triterpenoids were compared between 30， 50， 80 mesh common G. lucidum powder and 300 mesh G. lucidum ultramicro powder. RESULTS： The total extraction rates of triterpenoids from 30， 50， 80， 300 mesh G. lucidum powder were （0.74±0.08）%， （0.75±0.06）%， （0.78±0.06）%， （1.09±0.10）% （RSD<2%，n=3）， respectively. With the increase of the mesh number of G. lucidum powder， the contents of triterpenoids were increased gradually， and were the highest in 300 mesh， which was significant higher than common G. lucidum powder （P<0.05）. CONCLUSIONS： After ultrafine grinding， the dissolution of triterpenoids from G. lucidum is increased.

KEYWORDS Ganoderma lucidum； Ultrafine grinding technology； Triterpenoids； HPLC

靈芝（Ganoderma lucidum）為擔子菌類多孔菌科靈芝屬真菌，有紅色、黃色、白色和紫色等[1]。我國魯、云、貴、吉、浙、蘇、閩等省份分布著赤靈芝、紫靈芝、薄蓋靈芝等20多種靈芝，其中以泰山赤靈芝最為出名[2]。在祖國醫學中，靈芝應用由來已久，具有寧心安神、滋補強壯的功能，廣泛治療高血壓、高血脂、慢性肝炎、慢性腎炎、關節炎、失眠癥、神經衰弱、支氣管炎、胃潰瘍、氣喘病、動脈硬化、糖尿病、白細胞減少癥、厭食、蘑菇中毒、病后身體虛弱等癥[3]。

超微粉碎技術是指利用超細化的機械加工手段使粉體克服固體內部凝聚力使之粉碎至10～25 μm的操作技術。早在20世紀90年代，我國中藥行業就引入了超微粉碎技術，近年來該技術發展迅速。超微粉碎技術可顯著增加中藥溶出量和溶出率，提高有效成分生物利用度和溶出量[4]。本文研究了靈芝經超微粉碎后對其中主要成分三萜類成分（靈芝酸A、靈芝酸B、靈芝酸C、靈芝酸C1、靈芝酸C2、靈芝酸D、靈芝酸E、靈芝酸G、靈芝酸H）溶出的影響，旨在為靈芝中的進一步開發提供試驗依據。

1 材料

1.1 儀器

Q65-1CN電子天平（北京賽多利斯儀器有限公司）；Mastersizer 2000激光粒度分析儀（英國Malvern公司）；SYFM-8 Ⅱ超微粉碎機（濟南天方機械有限公司）；UV-9600紫外分光光度計（北京瑞利分析儀器有限公司）；1200 高效液相色譜（HPLC）儀（美國Agilent公司）。

1.2 藥材與試劑

靈芝（批號：151106）購自河北安國市伊康藥業有限公司，由天津中醫藥大學王傳福教授鑒定為擔子菌類多孔菌科靈芝；齊墩果酸、靈芝酸A、靈芝酸B、靈芝酸C、靈芝酸C1、靈芝酸C2、靈芝酸D、靈芝酸E、靈芝酸G、靈芝酸H對照品（批號：111985-201601、10356、1230-5026、35105、4150-896、12538、465601、236110、10233-365、107892）均購自中國食品藥品檢定研究院，純度：均≥99%；甲醇、乙酸乙酯、香草醛、冰醋酸、高氯酸等試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 靈芝普通粉和超微粉的制備

靈芝普通粉：取適量靈芝藥材常規粉碎，分別過30、50、80目篩，收集各組藥材粉末。靈芝超微粉：先將靈芝藥材粗粉碎，干燥至水分約為5%，經超微粉碎機粉碎45 min，經激光粒度儀測定90%粒徑分布[d（90）]<25 μm，過300目篩，即得。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液的制備 精密稱取靈芝酸A、靈芝酸B、靈芝酸C、靈芝酸C1、靈芝酸C2、靈芝酸D、靈芝酸E、靈芝酸G、靈芝酸H對照品各5 mg于10 mL量瓶中，甲醇溶解、定容，量取1 mL轉移至10 mL量瓶中，甲醇定容，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取靈芝普通粉和超微粉樣品各1 g，置于100 mL具塞錐形瓶中，加入50 mL乙酸乙酯，超聲（80 Hz，60 W）提取30 min，過濾、蒸干至無醇味，加甲醇轉移至10 mL量瓶中，定容。

2.3 三萜類成分總提取率比較

按照2015年版《中國藥典》（一部）靈芝項下三萜甾醇含量測定法測定三萜總提取率，三萜總提取率（%）=三萜總提取量/藥材質量×100%。精密量取齊墩果酸對照品或供試品溶液置于15 mL具塞試管中，揮干，冷卻，精密加入新配制的5%香草醛冰醋酸溶液0.2 mL，高氯酸0.8 mL，70 ℃水浴15 min后，立即冰浴5 min，加入乙酸乙酯4 mL。紫外-可見分光光度法于546 nm波長處測定吸光度，以齊墩果酸含量計算三萜類成分總提取率。結果，30、50、80目靈芝普通粉和300目靈芝超微粉三萜類成分總提取率分別為（0.74±0.08）%、（0.75±0.06）%、（0.78±0.06）%、（1.09±0.10）%（RSD<2%，n=3），300目靈芝超微粉中三萜類成分總提取率顯著高于靈芝普通粉（P<0.05）。

2.4 9種三萜類成分的含量測定

2.4.1 色譜條件與系統適用性考察 色譜柱：Agilent XDB C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B），梯度洗脫（0～30 min，26%～29%A；30～58 min，29%～35%A；58～73 min，35%～38%A）；柱溫：35 ℃；流速：1.0 mL/min；檢測波長：252 nm；進樣量：20 μL。該色譜條件下，取“2.2.1”“2.2.2”項下溶液進樣測定，結果各個峰分離度均大于1.5。色譜圖見圖1。

2.4.2 線性關系與定量限考察 精密吸取混合對照品溶液0.25、0.50、0.75、1.0、1.5 mL于10 mL量瓶中，甲醇定容后搖勻，按“2.4.1”項下色譜條件進樣測定，以各成分進樣量為橫坐標（x）、峰面積為縱坐標（y）進行線性回歸。結果見表1。

2.4.3 精密度、穩定性、重復性試驗 取供試品溶液，按“2.4.1”項下色譜條件連續進樣6 次，計算各成分峰面積RSD以考察精密度；取供試品溶液，分別在0、2、4、8、16 、24 h時，按“2.4.1”項下色譜條件連續進樣6 次，計算各成分峰面積RSD以考察穩定性；取300目靈芝粉末6 份，按“2.2.2”項下方法平行制成供試品溶液并測定，計算各成分峰面積RSD以考察重復性。精密度、穩定性和重復性試驗結果見表2。

由表2可知，靈芝酸A、靈芝酸B、靈芝酸C、靈芝酸C1、靈芝酸C2、靈芝酸D、靈芝酸E、靈芝酸G、靈芝酸H峰面積的RSD均不大于2%（n=6），表明本方法精密度、重復性良好，24 h內供試品溶液穩定。

2.4.4 加樣回收率試驗 取已知含量的300目靈芝粉末3份，分別精密加入9種混合對照品溶液1.5 mL，按“2.2.2”項下方法平行制成供試品溶液并進樣測定，計算各成分回收率。結果，靈芝酸A、靈芝酸B、靈芝酸C、靈芝酸C1、靈芝酸C2、靈芝酸D、靈芝酸E、靈芝酸G、靈芝酸H的回收率為98.11%～103.83%（RSD≤1.56%，n=3），符合相關要求，結果見表3。

2.4.5 樣品含量測定 取“2.1”項下靈芝普通粉與靈芝超微粉各3份，按“2.2.2”項下方法處理后，按“2.4.1”項下色譜條件進樣測定。結果，隨著靈芝粉目數的增大，靈芝酸A、靈芝酸B、靈芝酸C、靈芝酸C1、靈芝酸C2、靈芝酸D、靈芝酸E、靈芝酸G、靈芝酸H含量逐漸增大，其中300目含量最大，結果見表4。

3 討論

超微粉碎技術是一種將固體材料粉碎成10～25 μm粉體的技術，在食品、醫藥和化妝品領域具有廣泛應用。目前常用的粉碎機有振動超細粉碎機、氣流粉碎器、研磨剪切超細粉碎機、高速攪拌研磨機等[4-6]。超微粉碎技術在中藥材領域的應用逐漸受到重視，該技術不僅粉碎速度快，粉末粒度小而均勻，而且藥材細胞破壁率高，有利于提高有效成分的溶出率[7]。

三萜類化合物是靈芝的主要有效成分之一，目前在靈芝中已知的三萜類化合物已有100多種，既往研究顯示，靈芝三萜具有抗人類免疫缺陷病毒（HIV）、護肝、抗高血壓、抑制組胺釋放、抗腫瘤等廣泛的藥理活性[8-10]。而三萜類成分的提取率直接關系到靈芝藥效的發揮。本研究建立了靈芝中9種三萜類成分的HPLC分析方法，經精密度試驗、穩定性試驗、重復性試驗等考察，該方法全部達標。本研究結果顯示，30、50、80目靈芝普通粉和300目靈芝超微粉三萜類成分總提取率分別為（0.74±0.08）%、（0.75±0.06）%、（0.78±0.06）%、（1.09±0.10）%，300目靈芝超微粉三萜類成分總提取率顯著高于靈芝普通粉（P<0.05），表明超微粉碎技術有助于靈芝三萜類成分的溶出。

目前，超微粉碎技術能促進中藥材中有效成分的溶出已得到廣泛證實。如何春龍等[11]報道稱，通過采用靈芝超微粉和普通粉的三萜類成分指紋圖譜分析方法，發現靈芝藥材經過超微粉碎后三萜類成分種類沒有改變，但單含量提高，認為該技術能有效促進靈芝三萜類成分的溶出，與本研究結果一致。吳長輝[12]報道稱，采用超微粉碎技術將靈芝粉碎成300 目粉體，可大幅提高靈芝總多糖的提出率和溶出速度。黃建城[13]報道稱，采用超微粉碎技術粉碎靈芝能明顯提高靈芝多糖提取率。這主要是由于超微粉碎技術一方面提高了藥材細胞的破壁率，有助于有效成分的溶出，另一方面超微粉具有很強的表面親和性、吸附性和溶解性，可提高有效成分釋放速率[14-15]。因此，超微粉碎技術在中藥提取中具有極大的優勢，可以提高中藥中有效成分的溶出和臨床藥效，適合溶出度較低的中藥制劑的生產，有利于減少藥材用量、節約成本。

綜上所述，靈芝經超微粉碎后，有助于靈芝三萜類成分的溶出，降低其臨床使用量，從而節約藥材用量。

參考文獻

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（收稿日期：2017-07-04 修回日期：2017-12-26）

（編輯：劉明偉）