基于光譜法的脾虛脹滿合劑指紋圖譜研究

張文文，伍文彬，楊　慧，曾琦璐，鐘林江，張文靜

(1.成都大學 四川抗菌素工業研究所，四川 成都　610052；2.成都中醫藥大學 附屬醫院，四川 成都　610075；3.成都大學 藥學與生物工程學院，四川 成都　610106)

0　引　言

隨著中藥與中藥制劑的廣泛應用，其質量控制一直都是中藥研究與生產中的難點與熱點，也是實現中藥現代化生產的關鍵[1].由于中藥含有的化學種類成分較多且復雜，測定其中少數幾種成分指標難以完全定性，所以中藥的質量控制比合成的化學藥品難度要大很多.同時，因中藥中這些成分通常在治療方面具有協同作用，故應從化學成分整體角度評價其質量[2-4].中藥指紋圖譜是基于對中藥物質整體作用的認識，借助于波譜和色譜等技術手段獲得中藥化學成分的光譜或色譜圖，可以較充分地反映出中藥復雜混合體系中各種化學成分量分布的整體狀況，并將一些未明確的有效成分表征在圖譜中，這對藥物質量的控制和評價具有重要意義[5-8].中藥指紋圖譜包括紅外光譜法、紫外光譜法、核磁共振波譜法、電化學法、薄層色譜法、高效液相色譜法、氣相色譜法、毛細管電泳法等[9].其中，紫外—可見指紋圖譜法能反映樣品在200～900 nm波長下的吸收情況，具有簡便快速、綜合信息量大的特點；紅外指紋圖譜是混合物中各組分紅外光譜的疊加，對中藥的定性鑒別有良好的專一性，并且具有快捷、簡單以及測試成本低廉等優點[10-11].

脾虛脹滿合劑是由枳殼、生白術、干姜、檳榔、紫蘇葉與炙甘草等多味中藥組成的臨床經驗方，具有健脾行氣、消痞除滿之功效，常用于脾虛氣滯證見腹脹腹滿、不欲飲食、大便不暢、苔白膩與脈沉細者[12].本課題在前期研究中，已建立了脾虛脹滿合劑的初步質量標準，包括枳殼、干姜、炙甘草的薄層鑒別項，以及柚皮苷、新橙皮苷、甘草苷和甘草酸的含量測定項.因脾虛脹滿合劑由6味中藥組成，化學成分眾多，故其指標性成分不能代表其真實的發揮藥效的物質基礎，測定少數指標成分不足以說明合劑的質量.對此，本研究采用紫外指紋圖譜和紅外指紋圖譜這2種中藥指紋圖譜分析方法，并增加了對脾虛脹滿合劑在可見波長下吸收情況的分析，建立脾虛脹滿合劑的紫外—可見指紋圖譜和紅外指紋圖譜2種評價方法，以從整體上控制和評價本品的質量.

1　材料與儀器

1.1　材　料

實驗所用的材料包括：溴化鉀(光譜純，批號，2017042101)，由成都科隆化學品有限公司生產；水為純凈水；脾虛脹滿合劑10批，自制.本研究前期對脾虛脹滿合劑的柚皮苷、新橙皮苷、甘草苷及甘草酸含量進行了測定，并規定了限度.其中5批樣品符合規定，5批樣品不符合規定(見表1).

表1　10批脾虛脹滿合劑樣品含量測定結果

注：“√"符合規定的限度；“×"不符合規定的限度.

1.2　儀　器

實驗所用儀器包括：Tu-1810型紫外—可見分光光度儀(北京普析通用儀器有限責任公司)；Spectrum Two型紅外光譜儀(Pekin Elmer公司)；BS-6KH型電子天平(上海有聲衡器有限公司)；FW-5型壓片機(天津博天勝達科技發展有限公司)；LD510-2R型電子天平(沈陽龍騰電子有限公司).

2　方法與結果

2.1　紫外—可見指紋圖譜

2.1.1測試條件.

實驗中，以水調整基線并作為參比液進行紫外光譜測定，使用UVWin紫外軟件V6.0.0采集光譜，設定掃描波長為200～900 nm，光譜帶寬為2 nm，采樣間隔為1 nm，快速掃描，自動切換波長為361 nm.

2.1.2供試品制備方法.

1)精密吸取脾虛脹滿合劑(批號，20170215)1 mL于100 mL容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，制得供試品溶液a.

2)精密吸取脾虛脹滿合劑(批號，20170215)0.5 mL于100 mL容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，制得供試品溶液b.

3)精密吸取脾虛脹滿合劑(批號，20170215)2 mL于10 mL容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，吸取1 mL于100 ml容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，制得供試品溶液c.

4)精密吸取脾虛脹滿合劑(批號，20170215)1 mL于10 mL容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，吸取0.4 mL于100 mL容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，制得供試品溶液d.

5)精密吸取脾虛脹滿合劑(批號，20170215)0.1 mL于10 mL容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，吸取2 mL于100 mL容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，制得供試品溶液e.

按“2.1.1"項下的測試條件對供試品進行測定，結果見圖1.其中，供試品溶液d的紫外—可見圖譜的吸光度大小適宜，峰谷明顯.故供試品的制備方法確定為：取脾虛脹滿合劑1 mL于10 mL容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，吸取0.4 mL于100 mL容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻(即將脾虛脹滿合劑用水稀釋2 500倍)，即得.

圖1脾虛脹滿合劑稀釋2 500倍的紫外—可見圖譜

2.1.3精密度實驗.

取脾虛脹滿合劑(批號，20170215)，按“2.1.2"項下的方法制備供試品溶液，按“2.1.1"項下的測試條件連續測定6次.計算所得紫外—可見圖譜在波長200 nm、223 nm、252 nm、282 nm、308 nm處吸光度的RSD%分別為0.35%、0.07%、0.29%、0.14%、0.45%.結果表明，儀器精密度良好.

2.1.4穩定性實驗.

取脾虛脹滿合劑(批號，20170215)，按“2.1.2”項下的方法制備供試品溶液，按“2.1.1"項下的測試條件，每隔1h測定1次.5 h內計算所得紫外—可見圖譜在波長200 nm、223 nm、252 nm、282 nm、308 nm處吸光度的RSD%分別為0.57%、0.16%、0.94%、0.48%、1.54%.結果表明，樣品在5 h內穩定性良好.

2.1.5重復性實驗.

取脾虛脹滿合劑(批號，20170215)，按“2.1.2"項下的方法制備供試品溶液，平行6份，并按“2.1.1"項下的測試條件，分別測定.計算所得紫外—可見圖譜在波長200 nm、223 nm、252 nm、282 nm、308 nm處吸光度的RSD%分別為1.62%、0.97%、1.42%、0.98%、1.51%.結果表明，本方法重復性良好.

2.1.6脾虛脹滿合劑紫外—可見光譜采集.

取10批脾虛脹滿合劑樣品，按“2.1.2"項下的方法制備供試品溶液，按“2.1.1"項下的測試條件分別進行測定.10批脾虛脹滿合劑樣品的紫外—可見光譜疊加圖如圖2所示.

圖210批脾虛脹滿合劑樣品的紫外光譜疊加圖

2.1.7對照紫外—可見指紋圖譜的建立.

選擇在前期研究中含量測定符合規定的4批樣品(批號，20170215、20170220、20170227、20170305)，以其吸收強度的平均值為對照指紋圖譜的吸收強度，得到對照紫外—可見指紋圖譜如圖3所示.

圖3脾虛脹滿合劑的對照紫外—可見指紋圖譜

2.2　紅外指紋圖譜

2.2.1樣品制備.

用平頭微量進樣針取10 μL脾虛脹滿合劑于瑪瑙研缽中，揮干，加入100 mg溴化鉀，沿同一方向研磨均勻，取適量研細后的粉末平鋪于紅外壓片模具中，以15 MPa壓力壓制2 min，將制備好的樣片置于紅外光譜儀中測定紅外光譜.

2.2.2精密度考察.

取脾虛脹滿合劑(批號，20170220)，按照“2.2.1”項下的方法壓片，并連續測定6次.計算所得紅外圖譜中各特征峰的波數的RSD%分別為，0.0042%、0.0057%、0.0003%、0.0037%、0.0061%、0.0026%、0.0039%、0.1304%.結果表明，儀器精密度良好.

2.2.3穩定性實驗.

取脾虛脹滿合劑(批號，20170220)，按照“2.2.1”項下的方法壓片，置于干燥器中保存，分別在0 h、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h時測定.計算所得紅外圖譜中各特征峰的波數的RSD%分別為，0.0036%、0.0780%、0.0016%、0.0126%、0.0077%、0.0034%、0.0067%、0.0817%.結果表明，樣品在5 h內穩定性良好.

2.2.4重復性實驗.

取脾虛脹滿合劑(批號，20170220)，按照“2.2.1”項下的方法，平行壓制6片，測定，計算所得紅外圖譜中各特征峰的波數的RSD%分別為，0.0272%、0.0725%、0.0040%、0.01767%、0.0135%、0.0651%、0.0367%、0.1815%.結果表明，本方法的重復性良好.

2.2.5脾虛脹滿合劑紅外光譜采集.

取10批脾虛脹滿合劑樣品，按“2.2.1"項下的方法壓片并分別測定，10批脾虛脹滿合劑樣品的紅外光譜疊加圖見圖4.

圖410批脾虛脹滿合劑樣品的紅外光譜疊加圖

2.2.6對照紅外指紋圖譜的建立.

選擇在前期研究中含量測定符合規定的4批樣品(批號為，20170215、20170220、20170227、20170305)，以其透光率的平均值為對照指紋圖譜的透光率，得到對照紅外指紋圖譜如圖5所示.

圖5脾虛脹滿合劑對照紅外指紋圖譜

2.3　限度要求

10批脾虛脹滿合劑的紫外—可見指紋圖譜在波長200 nm、223 nm、252 nm、282 nm、308 nm處的吸光度值如表2所示.

將脾虛脹滿合劑樣品的紫外—可見指紋圖譜、紅外指紋圖譜分別與得到的對照指紋圖譜進行相似度分析[13-14]，經數據處理軟件“IBM SPSS statistics"中雙變量相關“Kendall的tau-b"分析計算相似度.綜合用于建立對照紫外—可見指紋圖譜的4批脾虛脹滿合劑在特征波長下的吸光度值、脾虛脹滿合劑樣品的紫外—可見指紋圖譜、紅外指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度.脾虛脹滿合劑紫外—可見指紋圖譜的吸光度值應分別滿足200 nm(0.954～1.371 Abs)、223 nm(0.477～0.687 Abs)、252 nm(0.122～0.174 Abs)、282 nm(0.248～0.361 Abs)、308 nm(0.104～0.149 Abs)，紫外—可見指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度應不小于0.925，紅外指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度應不小于0.861，結果如表3所示.

表2　10批脾虛脹滿合劑紫外—可見指紋圖譜吸光度值

表3　脾虛脹滿合劑指紋圖譜相似度分析結果

前期研究中，含量符合規定的脾虛脹滿合劑(批號：20170303)，其紫外—可見指紋圖譜在200 nm，223 nm，252 nm，282 nm，308 nm處的吸光度值滿足標準，紫外—可見指紋圖譜與紫外—可見對照指紋圖譜的相似度為0.930，高于限度0.925，紅外指紋圖譜與對照紅外指紋圖譜的相似度為0.942，高于限度0.861.而含量不合格的5批樣品的吸光度或相似度均不滿足限度要求.

3　結　論

由于脾虛脹滿合劑中藥材較多，干擾較大，課題組尚未建立其他4味藥材定性定量控制方法，故采用紫外—可見圖譜與紅外圖譜的分析方法，并增加了對樣品在可見波長下吸收情況的分析，建立脾虛脹滿合劑對照紫外—可見指紋圖譜和對照紅外指紋圖譜，從吸光度、樣品圖譜與對照圖譜相似度等方面對脾虛脹滿合劑的質量進行綜合分析.

本研究首次將紫外—可見指紋圖譜、紅外指紋圖譜應用到脾虛脹滿合劑的質量評價中，確定了測試條件和供試品制備方法，并建立了脾虛脹滿合劑的對照紫外—可見指紋圖譜與對照紅外指紋圖譜，對脾虛脹滿合劑樣品進行了吸光度與相似度的分析.結合脾虛脹滿合劑含量測定方法[12]與紫外—可見指紋圖譜與紅外指紋圖譜分析方法，在測定指標性成分的同時，可從整體上控制脾虛脹滿合劑的質量，從而提升脾虛脹滿合劑的質量標準.