高效液相色譜法測定阿莫西林克拉維酸鉀咀嚼片中的有關物質

聶忠莉，楊　慧，王曉玲，黃金玉，張　勇，蕭茂玲

(1.成都大學 藥學與生物工程學院，四川 成都　610106；2.成都克萊蒙醫藥科技有限公司，四川 成都　610041)

0　引　言

阿莫西林克拉維酸鉀咀嚼片，是由阿莫西林三水合物和克拉維酸鉀組成的復方制劑，阿莫西林為殺菌性廣譜抗生素，克拉維酸鉀為不可逆的廣譜β-內酰胺酶抑制劑，其可有效抑制耐藥菌產生，使已對阿莫西林耐藥并產生β-內酰胺酶的細菌仍然對阿莫西林敏感[1].阿莫西林克拉維酸鉀咀嚼片臨床上用于因β-內酰胺酶流感嗜血桿菌和卡他莫拉菌所致的下呼吸道感染、中耳炎、鼻竇炎的治療，以及產β-內酰胺酶金葡菌和產酶腸桿菌科細菌如大腸埃希菌、克雷伯菌屬所致的尿路和皮膚軟組織抗感染等[2].目前，阿莫西林克拉維酸鉀咀嚼片注冊標準中沒有有關物質檢查項，對此，本研究為了更好地控制其質量，參照阿莫西林克拉維酸鉀片質量標準[3]中有關物質的測定方法，利用高效液相色譜法迅速、準確、靈敏度高與專屬性強的特點[4-5]對阿莫西林克拉維酸鉀咀嚼片中的有關物質進行測量.

1　材料與儀器

1.1　材　料

實驗所用材料包括：阿莫西林克拉維酸鉀咀嚼片(批號，161001、161002、161003)，由四川制藥制劑有限公司生產；雜質D(批號，56293，純度≥92.3%)、雜質J(批號，R064U0，混合物)、雜質C(批號，39563，純度≥96.3%)，由LGC公司生產；阿莫西林對照品(批號，130409-201512，純度≥86.9%)、克拉維酸對照品(批號，130409-201307，純度≥95.0%)、阿莫西林克位維酸系統適用性實驗對照品(批號，130588-201202)，由中國食品藥品檢定研究院提供；乙腈為色譜純、磷酸二氫鉀為分析純，由成都科龍化工試劑廠生產.

1.2　儀　器

實驗所用儀器包括：5410/L-2455型高效液相色譜儀(Hitachi公司)；BP-210D型電子天平(Sartorius公司)，pHS-3C型酸度計(上海佑科儀器儀表有限公司).

2　方法與結果

2.1　色譜條件

實驗色譜條件為：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動相A為0.01 mol/L磷酸二氫鉀溶液(用2 mol/L氫氧化鈉溶液調節pH值至6.0)，流動相B為0.01 mol/L磷酸二氫鉀溶液(用2 mol/L氫氧化鈉溶液調節pH值至6.0)—乙腈(20∶80)，檢測波長為230 nm；先以流動相A—流動相B(98∶2)等度洗脫，待阿莫西林洗脫完畢后立即按表1流程進行線性梯度洗脫.

表1　梯度洗脫程序表

2.2　溶液配制

2.2.1供試品溶液配制.

取本品的細粉適量，加流動相A溶解(必要時冰浴超聲5～10 min助溶)并稀釋制成每1 mL中含阿莫西林(按C16H19N3O5S計)2 mg的溶液，濾過，取續濾液，作為供試品溶液.

2.2.2對照溶液配制.

精密量取供試液適量，用流動相A定量稀釋制成每1 mL中含阿莫西林(按C16H19N3O5S計)40 μg的溶液，作為對照溶液.

2.3　系統適用性及雜質定位

精密稱取阿莫西林克拉維酸系統適用性實驗對照品，加入流動相A溶解并稀釋制成每1 mL中約含阿莫西林2.5 mg的溶液，作為系統適用性對照品溶液，取20 μL注入液相色譜儀，連續進樣6次.結果見表2、3及圖1、2.

表2　阿莫西林克拉維酸系統適用性實驗峰面積結果

表3　阿莫西林克拉維酸系統適用性實驗峰保留時間結果(min)

精密稱取雜質C、雜質D、雜質J對照品適量，分別加入流動相A溶解并稀釋制成每1 mL含上述雜質1 mg的儲備液.精密量取儲備液適量，分別加流動相A稀釋制成每1 mL含上述雜質0.1 mg的定位溶液，各取20 μL注入液相色譜儀，結果見表4.

實驗數據顯示，記錄的色譜圖與標準圖譜一致，且阿莫西林、克拉維酸及各雜質主峰峰面積的RSD%小于2.0%、保留時間RSD%小于1.0%，定位溶液的主峰與系統圖譜中相應雜質峰的保留時間一致.結果表明，該色譜條件下的系統適用性良好.

圖1阿莫西林克拉維酸制劑有關物質用標準譜圖

圖2阿莫西林克拉維酸系統適用性對照品溶液圖譜

表4　定位實驗結果

2.4　專屬性實驗

取本品(批號，161001)10片，精密稱定，研細，分別精密稱取細粉適量，再進行強酸、強堿、氧化、高溫和光照破壞性實驗.分別精密量取上述溶液20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結果見表5及圖3.

表5　阿莫西林克拉維酸有關物質專屬性實驗結果

從表5和圖3可知：空白溶劑和空白輔料無干擾；在各破壞條件下，阿莫西林峰與相鄰雜質峰之間的分離度均大于1.5，克拉維酸峰與相鄰雜質峰之間的分離度雖小于1.5，但與阿莫西林克拉維酸鉀系統適用性圖譜一致；降解平衡在90%～100%之間.因此，在本條件下系統專屬性良好.

圖3未破壞樣品HPLC圖譜

2.5　檢測限與定量限確定

取阿莫西林、克拉維酸鉀、雜質C與雜質D對照品適量，加入流動相A溶解并稀釋制成每1 mL含阿莫西林2 mg、克拉維酸鉀0.3 mg、雜質C 0.1 mg、雜質D 0.1 mg的儲備液.精密量取各儲備液適量，加流動相A稀釋制成一定濃度的溶液，取此溶液20 μL進樣，記錄色譜圖，計算信噪比，以信噪比約3∶1為檢測限，以信噪比約10∶1為定量限.檢測結果為：阿莫西林、克拉維酸鉀、雜質C與雜質D檢測限分別是0.06 μg、0.012 μg、0.06 μg與0.013 μg；定量限分別是0.55 μg、0.04 μg、0.551 μg與0.062 μg.

2.6　線性范圍考察

取“2.5”項下阿莫西林、克拉維酸鉀、雜質C與雜質D儲備液適量，置同一量瓶中分別用流動相A稀釋至適宜的濃度，作為線性供試品溶液，分別精密量取各線性溶液20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖.以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標做標準曲線.結果顯示：阿莫西林雜質C在濃度為0.11～105.74 μg/mL范圍內，進樣20 μL，其峰面積與濃度呈良好的線性關系，線性方程式為，Y=39.335x+4.4896，R2=0.9999；阿莫西林雜質D在濃度為0.10～97.38 μg/mL范圍內，進樣20 μL，其峰面積與濃度呈良好的線性關系，線性方程式為，Y=30.0364x+5.9779，R2=0.9999；阿莫西林在濃度為0.11～105.15 μg/mL范圍內，進樣20 μL，其峰面積與濃度呈良好的線性關系，線性方程式為，Y=30.0343x+4.8544，R2=0.9999；克拉維酸在濃度為0.10～101.94 μg/mL范圍內，進樣20 μL，其峰面積與濃度呈良好的線性關系，線性方程式為，Y=23.5674x+5.0952，R2=0.9999.

2.7　準確度實驗

精密稱取研細后的本品細粉各65.7 mg，共10份，置于10 mL量瓶中.1～3號精密加入雜質儲備液(含雜質C 0.1 mg/mL、雜質D 0.2 mg/ml)0.5 mL，作為50%的供試品樣；4～6號精密加入雜質儲備液(含雜質C 0.1 mg/mL、雜質D 0.2 mg/mL)1 mL，作為100%的供試品樣；7～9號精密加入雜質儲備液(含雜質C 0.1 mg/mL、雜質D 0.2 mg/mL)1.5 mL，作為150%的供試品樣；10號作為未加雜質的供試品樣.分別向1～10號加流動相A至8 mL，冰浴超聲提取10 min，取出，放至室溫，加流動相A至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，作為供試品溶液.

取雜質儲備液適量，加入流動相A稀釋制成每1 mL中約含雜質C 0.01 mg、雜質D 0.02 mg的溶液，作為對照品溶液；另精密量取各供試品溶液1 mL，置于50 mL量瓶中，用流動相A稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液.

取上述對照溶液、對照品溶液和供試品溶液20 μL，注入液相色譜儀分別測定.分別按外標法、自身對照法計算各雜質含量.結果顯示：采用自身對照法測定咀嚼片中阿莫西林雜質C的平均回收率為121.28%，RSD為2.9%，雜質D的平均回收率為94.98%，RSD為4.3%，回收率不符合要求；采用外標法測定咀嚼片中阿莫西林雜質C的平均回收率為98.72%，RSD為2.4%，雜質D的平均回收率為96.98%，RSD為2.4%，各雜質的回收率均在90%～100%之間，RSD小于5.0%，回收率良好，準確度符合要求.

從兩種方法測定的雜質含量的數據可看出，自身對照法測定的雜質含量值均大于或相當于外標法測定的雜質含量值.因此，采用自身對照法測定雜質含量，仍能很好地控制本品中的雜質限度，其方法是可行的.

2.8　精密度實驗

2.8.1重復性實驗.

精密稱取研細后的本品細粉各65 mg共6份，分別加流動相A至8 mL，冰浴超聲提取10 min，取出，放至室溫，加流動相A至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，作為供試品溶液.另精密量取供試液1 mL，置50 mL量瓶中，用流動相A稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液.

取上述對照溶液和供試品溶液20 μL，注入液相色譜儀分別測定，分別按自身對照法計算各雜質含量，6份樣品測定含量基本一致，RSD%均小于10.0，說明重復性良好.

2.8.2進樣精密度實驗.

精密稱取研細后的本品細粉66.66 mg，加流動相A至8 mL，冰浴超聲提取10 min，取出，放至室溫，加流動相A至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，作為供試品溶液.精密量取供試液1 mL，置50 mL量瓶中，用流動相A稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液.

取上述對照溶液20 μL，連續進樣6次，記錄色譜圖，對照溶液6次連續進樣各成分峰面積RSD%均小于1.0，說明進樣精密度良好.

2.8.3中間精密度實驗.

由不同分析人員在不同時間、不同儀器上取重復性實驗項下細粉6份，同法測定.結果顯示，同一樣品由不同人員在不同時間、不同儀器上重復測定12次，RSD%的含量均小于20.0，說明中間精密度良好.

2.9　穩定性實驗

精密稱取研細后的本品細粉64.17 mg，加流動相A至8 mL，冰浴超聲提取10 min，取出，放至室溫，加流動相A至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，作為供試品溶液.精密量取供試液1 mL，置50 mL量瓶中，用流動相A稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液.分別在0、2、4、6、8 h取供試品溶液及對照溶液20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按自身對照法計算各雜質含量.結果顯示：同一樣品，對照溶液分別在0、2、4、6、8 h內連續進樣，各雜質和主峰面積均無明顯變化，峰面積RSD均小于1.0%，對照溶液在8 h內穩定；供試品溶液雜質含量隨時間推移在不斷增加，但在2 h內變化較小，8 h內雖然增加，但在仍標準規定的范圍內.因此，對本品有關物質的測定最好在樣品配制2 h內進樣.

2.10　耐用性實驗

精密稱取研細后的本品細粉66.11 mg，加流動相A至8 mL，冰浴超聲提取10 min，取出，放至室溫，加流動相A至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，作為供試品溶液.精密量取供試液1 mL，置50 mL量瓶中，用流動相A稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液.

取上述供試品和對照溶液和空白溶劑，按表6相關數據改變流動相流速、pH值與不同色譜柱等因素來考察變動因素對含量測定的影響，結果如表6所示.

表6　阿莫西林有關物質耐用性實驗結果(%)

表6數據顯示，當在流動相流速與pH值發生微小變化，以及更換不同品牌的色譜柱的情況下，測定樣品中各雜質含量以及各成分峰之間的分離度與原條件變化不大.此表明本方法的耐用性良好.

2.11　樣品中有關物質測定

按驗證后符合要求的方法，分別對3批樣品進行了檢測，并分別以對照溶液中的2個主峰面積和以及阿莫西林峰計算各雜質的含量，結果如表7、8所示.

表7　3批樣品有關物質各雜質含量(%)測定結果

表8　3批樣品有關物質各雜質含量(%)測定結果

表7、8數據表明，阿莫西林克拉維酸鉀咀嚼片有關物質測定結果3批樣品均符合規定.

3　結　論

本研究通過高效液相色譜法測定阿莫西林克拉維酸鉀咀嚼片中的有關物質方法學驗證實驗表明：采用自身對照法測定雜質含量，能很好地控制本品中的雜質限度，即采用自身對照法測定本品雜質含量的方法是可行的.