風濕類產品中非法添加對乙酰氨基酚快檢方法的研究

張錦文 謝靖威 郭素

（廣州市從化區食品藥品檢驗所 廣東 廣州 510900）

1.研究背景

對乙酰氨基酚，化學名為4-羥基乙酰苯胺，英文名為4-Acetamidophenol,CAS No.103-90-2,分子式為C8H9NO2。化學結構為：

有解熱鎮痛作用，是最常見的非抗炎解熱鎮痛藥，是乙酰苯胺類藥物中最好的品種。特別適用于不能應用羧酸類藥物的病人。被廣泛用于感冒發燒、關節痛、神經痛、及手術后止痛等，不良反應較少。偶見皮疹、蕁麻疹、藥熱、血小板減少癥及白細胞減少癥（如粒細胞減少）。長期大量用藥會導致肝腎功能異常。劑量過大可引起肝臟損害，嚴重可致昏迷甚至死亡。

最近，有文獻和新聞報道，某些中藥制劑和保健食品中有人非法添加對乙酰氨基酚以增強其藥效[1,2,3]。如果消費者購買服用該類產品，極有可能攝取過量的對乙酰氨基酚導致產生不良反應。對此類非法添加行為，應予嚴厲打擊。國家食品藥品監督管理局曾發布藥品檢驗補充檢驗方法和檢驗項目批準件（批準件編號：2009025）對抗風濕類中成藥非法添加對乙酰氨基酚進行檢驗。

目前有人使用高效液相色譜、質譜對非法添加對乙酰氨基酚進行檢驗[1,2]，也有人嘗試使用薄層色譜對非法添加對乙酰氨基酚進行快檢[3]，但尚無非法添加對乙酰氨基酚化學鑒別快速檢測方法的報道。

2.文獻調研

目前常用的快檢方法主要是近紅外、拉曼光譜、車載液相、等手段。目前常用的非法添加化學成分理化檢驗快速篩查的方法具有類似的實施步驟：提取樣品中的目標化學成分。消除基質干擾，加入檢測劑，產生沉淀或顯色反應，陽性結果為添加，陰性結果為未添加。

《中國藥典》2015年版二部[4]中，對乙酰氨基酚化學鑒別：（1）本品的水溶液加三氯化鐵試液，即顯藍紫色。（2）取本品約0.1g，加稀鹽酸5ml，置水浴中加熱40分鐘，放冷；取0.5ml，滴加亞硝酸鈉試液5滴，搖勻，用水3ml稀釋后，加堿性β-萘酚試液2ml，振搖，即顯紅色。對乙酰氨基酚片鑒別：（1）取本品的細粉適量（約相當于對乙酰氨基酚0.5g），用乙醇20ml分次研磨使對乙酰氨基酚溶解，濾過，合并濾液，蒸干，殘渣照對乙酰氨基酚項下的鑒別（1）、（2）項試驗，顯相同的反應。

對乙酰氨基酚鑒別（1）的原理[5]為對乙酰氨基酚中的結構中有酚羥基，遇三氯化鐵試液產生藍紫色絡合物。鑒別（2）的原理為對乙酰氨基酚在酸性介質中水解后生成對氨基酚，滴加亞硝酸鈉試液，生成重氮鹽，再加堿性B-萘芬試液，生成紅色偶氮化合物。《藥品快速檢測技術研究與應用》化藥卷[6]一書中也使用對乙酰氨基酚與三氯化鐵的顯色反應來鑒別對乙酰氨基酚類藥品。

3.快檢方法設計與優化

3.1 提取劑的選擇

對乙酰氨基酚在熱水或乙醇中易溶，在丙酮中溶解，在水中略溶。參考《藥品快速檢測技術研究與應用》一書，對于膠囊、片劑、顆粒劑等固體制劑，使用氯仿：甲醇：丙酮（9∶2∶1）作為提取溶劑，取上清液，使用0.45um微孔濾頭過濾滴加檢測劑，液體制劑如澄清，不用另加提取劑，直接滴加檢測劑即可。如渾濁或顏色過深，可過濾或適當稀釋后滴加檢測劑。膏體糖分高，粘稠，直接加入檢測劑效果不好（有待實驗驗證），加入氯仿：甲醇：丙酮（9∶2∶1）振搖提取后靜置片刻，可分層，取上層（即氯仿：甲醇：丙酮（9∶2∶1）作為供試液即可。

3.2 檢測劑的選擇

對乙酰氨基酚結構簡單，官能團少，本次文獻調研沒有查閱到可借鑒的沉淀反應，因此只能采用顯色反應。《中國藥典》2015年版二部對乙酰氨基酚鑒別（2）需要在水浴中加熱40分鐘，快檢車難以提供必要的水浴設備，不適用于快檢。鑒別（1）反應簡單，專屬性強，比較適合。因此，選用9%三氯化鐵水溶液作為檢測劑。

4.擬定的快檢方法

液體制劑（露、糖漿、溶液等）：取液體制劑樣品約1ml置試管中，加入氯仿：甲醇：丙酮（9∶2∶1）1～2ml,充分振搖后靜置分層，吸取適量溶劑層液體，滴加9%三氯化鐵水溶液，如有藍色、藍黑色或黑色等顏色產生，則為可疑樣品；如無明顯變色或變為其他顏色，則為陰性結果。對于比較澄清的液體，可直接滴加9%三氯化鐵水溶液檢測。

固體制劑（膠囊、片、丸、顆粒等）：膠囊取1粒內容物，片劑取1片，丸劑取2丸，顆粒劑取約1克，研磨均勻：置10ml具塞比色管中，加入氯仿：甲醇：丙酮（9∶2∶1）1～2ml，強力振搖混勻，靜置，取上清液濾過，取續濾液置試管中，滴加9%三氯化鐵水溶液，如有藍色、藍黑色或黑色等顏色產生，則為可疑樣品；如無明顯變色或變為其他顏色，則為陰性結果。

膏體：取膏劑藥品約1克置試管中，加入氯仿：甲醇：丙酮（9∶2∶1）1～2ml，充分振搖后靜置分層，吸取適量溶劑層液體，滴加9%三氯化鐵水溶液，如有藍色、藍黑色或黑色等顏色產生，則為可疑樣品；如無明顯變色或變為其他顏色，則為陰性結果。

5.快檢方法驗證

項目組在零售藥店收集31批不同廠家的抗風濕類中成藥：（1.強力天麻杜仲膠囊，2.風濕安泰片①，3.骨松寶膠囊，4.復方風濕寧片,5.壯骨關節丸，6.骨仙片，7.腰痛寧膠囊，8.盤龍七片，9.正清風痛寧片，10.云南紅藥膠囊，11.萬通筋骨片，12.小活絡丸，13.復方夏天無片，14.獨一味膠囊，15.追風透骨丸，16.天麻片，17.金烏骨通膠囊，18舒筋丸,19.抗骨增生片，20.舒筋活血片，21.伸筋丹膠囊，22.腰息痛膠囊，23. 腰痛片，24.強力天麻杜仲丸，25.風濕安泰片②，26.漢桃葉片，27.抗骨質增生丸，28.獨一味顆粒，29.風痛片，30.骨盤丸膠囊，31.維C銀翹片）。

采用液質聯用（LC-QTOF）確證樣品是否存在非法添加。由于收集到的含有對乙酰氨基酚的樣品較少，對于未添加對乙酰氨基酚而且快檢成陰性的樣品，采用了添加約20mg對乙酰氨基酚對照品的方法模擬非法添加。添加時使用研磨、超聲等方法使對照品和樣品混合均勻。

液質聯用驗證方法

對于樣品是否存在非法添加，使用液質聯用檢驗（LC-QTOF）作為最終確證方法，實驗條件如下：

色譜條件：Agilent1200RRLC高效液相

色譜柱： Agilent ZORBAX EclipsePlus,C18,最高耐受600bar，3.0*100mm

填料粒徑：1.8um Serial Number∶USWHH01323

柱溫：45℃ 流動性：水相：5mmol/L甲酸銨-0.1%甲酸有機相：甲醇

梯度洗脫條件：如下表。

表

質譜條件：

Agilent四極桿串聯飛行時間質譜（QTOF6538），ESI源，干燥氣溫度；320℃，干燥氣流速：10L/min，霧化器壓力：40psi，fragmentor∶135V,VCap∶4000, 參比霧化器壓力：5 psi，選用121和922作為參比離子實時校正。選用Targeted ms/ms模式，采用碎片離子和保留時間作為定向依據。

對照品溶液的制備：取對乙酰氨基酚對照品約10mg，置100ml量瓶中，緊密稱定，加純水溶解并定容至刻度，搖勻，得到每1ml含對乙酰氨基酚約100ug的對照品溶液。

供試品溶液的制備：取本品膠囊5粒內容物混勻，取約1粒內容物重量（膏、露、口服溶液、糖漿、顆粒制劑取約1g，片劑取1片，丸劑取3丸），置100ml量瓶中，精密稱定，加水適量，超聲10分鐘，放冷，用水稀釋至刻度，搖勻，濾過，作為供試品溶液。

測定法：分別取對照品溶液和供試品溶液各3ul，依次注入液相色譜儀，記錄質譜總離子流（TIC），一級質譜按質核比提取對乙酰氨基酚準分子離子的離子流（EIC），二級質譜選用Targated ms/ms模式，采用碎片離子和保留時間作為定性依據。

6.結果分析

31批樣品中，22,31共2批樣品標示含有對乙酰氨基酚，快檢結果顯陽性。10、23樣品未標示含有對乙酰氨基酚，液質結果未檢出對乙酰氨基酚，快檢呈陽性。其余27批樣品液質結果未添加對乙酰氨基酚，快檢成陰性，添加對乙酰氨基酚對照品后，快檢結果均呈陽性。

以上結果表明（1）對于添加了對乙酰氨基酚的樣品（包括添加對乙酰氨基酚對照品的樣品），該快檢方法均能檢驗未陽性，陽性檢出率為100%，假陰性為0%。（2）對于未添加對乙酰氨基酚的樣品，有10、23二批被快檢為陽性，其余27批均被檢出為陰性，真陰性率為93.1%，假陽性率為6.9%。

檢測靈敏度：取濃度約為100ug/ml的對乙酰氨基酚水溶液約1ml，滴加9%三氯化鐵水溶液，結果上層液有藍色產生，表明對于對乙酰氨基酚，該方法的檢測靈敏度可達到0.1mg。

[1]來國服,程斌,魯靜.LC-MS法測定抗風濕類中藥非法添加化學藥物成分[J].中國藥師,2013,13（4）：453-455.

[2]吳小紅，李煥德，吳高芬,等.HPLC-DAD法同時測定部分中成藥及保健食品中添加的9種解熱鎮痛藥物[J].藥物分析雜志,2010,30（10）1865-1868.

[3]張鶴，黃子桐，朱禹彭,等.關于抗風濕類中藥制劑中非法添加化學藥品 的檢測方法研究[J].亞太傳統醫藥,2010,6（6）：31-32.

[4]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2015年版二部，中國醫藥科技出版社，2015：234-235.

[5]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典1990年版二部藥典注釋，化學工業出版社，1990：182-184.

[6]邊振甲，李云龍，金少鴻,等.藥品快速檢測技術研究與應用化藥卷[M].化學工業出版社，2013：1061-1070.