Cu²⁺單獨污染對藜麥種子萌發及部分生理指標的影響

郝曉華 任美艷

摘 要：采用光照培養箱培養及紫外可見分光光度法，研究了不同濃度（50～200μmol·L-1）Cu2+單獨污染對藜麥幼苗體內可溶性蛋白的含量、SOD酶及過氧化氫酶的活性及其他生理特征的影響。結果表明，不同濃度的Cu2+對藜麥的可溶性蛋白含量、丙二醛含量以及葉片的相對電導率伴隨著Cu2+濃度的增加而增加；SOD酶及過氧化氫酶活性在隨著Cu2+濃度的增加而增加。在含有200μmol/lCu2+的環境下藜麥可以生存，但藜麥體內的保護系統受到一定程度的破壞，然而在低濃度時，Cu2+對藜麥的生長有一定的促進作用。

關鍵詞：Cu2+；藜麥；可溶性蛋白；SOD酶

中圖分類號 S519 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2018）11-0016-05

Abstract：This article using the light incubator to cultivate and atomic absorption spectrophotometry， different concentrations of copper ion was studied after pollution quinoa seedlings in soluble protein content，superoxide dismutase（SOD） and catalase activity and other physical characteristics. The results show that： different concentrations of copper ion of quinoa soluble protein content， malondialdehyde content and relative electrical conductivity increased with the increasing of the concentration of cupric ions. Superoxide dismutase and catalase activity also increased with the increasing of concentration of Cu2+. So quinoa under the environment of containing the highest concentration of copper ion can survive， but protection system in the body of the quinoa by a certain degree is damaged， but in low concentration， the growth of quinoa has a certain role in promoting.

Key word：Copper ion；Chenopodium quinoa willd；Soluble protein；Superoxide dismutase（SOD）

藜麥（Chenopodium quinoa willd）為雙子葉植物綱石竹目藜科藜屬植物[1]，具有耐寒、耐旱、耐瘠薄、耐鹽堿等特性。原產于南美洲安第斯山區，是印加土著居民的主要傳統食物，至今已有5000～7000多年的種植歷史。由于其營養豐富，食用價值高，且植株在自然肥力低的情況下仍能生長良好，被譽為未來最具潛力的農作物之一[2]。植株呈掃帚狀，根系屬淺根系，序狀花序，主梢和側枝都結籽，自花授粉。

近年來，伴隨著我國經濟的快速發展，環境也遭到了很大程度的破壞，如重金屬的污染使很多植物難以生存，或產量下降。Cu2+是一種重要的重金屬污染物，其在環境中易積累、難降解[1-2]，過量的銅可使作物細胞膜及多種細胞器的膜系統受損，使K+等從細胞中滲出，抑制多種酶的活性，從而造成毒害效應[3-4]。

本實驗主要研究了不同濃度的重金屬Cu2+單一污染在藜麥幼苗體內的過氧化氫酶活性、超氧化物歧化酶的活性以及可溶性蛋白和丙二醛含量的變化，為了解銅離子對藜麥的毒害機制和農業生產早期預報重金屬污染提供相關的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 試劑 Ca（NO3）2·4H2O、MgSO4·7H2O、CuCl2·2H2O、KNO3、KH2PO4、H3BO3、MnCl2·4H2O、ZnSO4·7H2O、Na2MoO4·2H2O、乙二胺四乙酸二鈉、Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、過氧化氫、高錳酸鉀、濃硫酸、Tris濃鹽酸、甘油、聚乙烯吡咯烷酮K30、考馬斯亮藍G-250、鄰苯三酚、三氯乙酸硫代巴比妥酸、牛血清蛋白、磷酸、95%乙醇、硫酸銅，所用試劑均為分析純。藜麥種子購于靜樂縣農貿市場。

1.1.2 試驗儀器 DKZ-450恒溫震蕩水浴鍋（常州諾基儀器有限公司）、UNICO UV-2102型紫外可見分光光度計（上海精密儀器有限公司）、LC-4016型低速離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）、HC-2062型高速離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）、BDS-11A電導率儀（上海雷磁新涇儀器有限公司）、FA2204B電子天平（上海精密儀器有限公司）、TD1102型電子天平（余姚市金諾天平有限公司）、YXQ-LS-50G立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海博迅儀器有限公司）、SPX-300B-G型光照培養箱（上海博訊實業有限公司醫療設備廠）、MCDE090100CF4實驗室pH計（廈門振源工業有限公司制造）。

1.1.3 溶液的配置 （1）Hoagland營養液（1L培養液加入的數量）：大量元素：Ca（NO3）2·4H2O 1.18g、KNO3 0.51g、 MgSO4·7H2O 0.49g、KH2PO4 0.14g。微量元素：H3BO3 2.86mg、MnCl2·4H2O 1.81mg、ZnSO4·7H2O 0.22mg、Na2MoO4·2H2O 0.03mg。每1L營養液中加入2mLFe-EDTA溶液（七水硫酸亞鐵2.78g，乙二胺四乙酸二鈉 3.73g，蒸餾水500mL，配置完成后，在黑暗并低溫下儲存）。（2）0.2mol/L pH7.8磷酸緩沖液：稱取Na2HPO4 22.70g、NaH2PO4 4.82g、用蒸餾水配制成1L；（3）0.1mol/L的過氧化氫溶液：取30%H2O2溶液5.68mL，稀釋至1000mL；（4）0.1mol/L高錳酸鉀（K2MnO4）：稱取KMnO4（AR）3.1605g，用新煮沸過的蒸餾水配制成0.1mol/L的高錳酸鉀溶液，并用草酸鈉溶液標定，放置7d后使用；（5）蛋白提取液（每100mL加入的數量）：Tris-HCl（pH=8.0）15mL、甘油25mL、聚乙烯吡咯烷酮K302g，定容于100mL。（6）0.05mol/LTris-HCl（pH=8.0）：50mL0.1mol/L Tris溶液與29.2mL的0.1mol/L鹽酸，用蒸餾水定容至100mL；（7）考馬斯亮藍G-250染液：取考馬斯亮藍G-250 100mg溶于50mL的95%乙醇中，加100mL的85%磷酸混勻，再用蒸餾水定容至1000mL；（8）鄰苯三酚（50mmol/L）：稱取鄰苯三酚0.063g，用10mmol/L HCl溶液溶解，定容至10mL，避光保存；（9）0.6%硫代巴比妥酸：取0.6g的硫代巴比妥酸，加少量的氫氧化鈉（1mol/L）溶解，再用10%的三氯乙酸定容至100mL。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料培養及實驗設計 選取大小均一、飽滿的藜麥種子，先用蒸餾水清洗，再用10%的NaClO消毒20min，然后用蒸餾水洗凈后，30℃溫水浴30min，置于18℃恒溫培養箱中培養5h。每50粒排列于鋪有數層紗布的培養皿中，共設置6個Cu2+濃度梯度，分別為CK（蒸餾水），50、100、150、200μmol/L。每個濃度處理重復3次，在20℃的光照培養箱中培養，每12h更換一次處理液。

1.2.2 銅離子脅迫下藜麥種子發芽指標 實驗中種子發芽均以胚根露白為發芽標準；第4天測定其發芽勢，第7天測定其發芽率，并采用普通直尺測量其主根長度和株高。相關計算公式如下：

發芽率（GP）=前7d種子總發芽數/供試種子數[10]；

發芽勢（GE）=前4d種子總發芽數/供試種子數[10-11]；

發芽指數（GI）=∑（Gt/Dt）[12]

式中：Dt為發芽日數；Gt為與Dt相應的發芽試驗終期內每日發芽數。

活力指數（vigor index，VI）=GI×第7天正常幼苗平均鮮重[13]

式中：幼苗鮮重為稱取5株幼苗的重量。

1.2.3 生理指標測定 MDA含量采用硫代巴比妥酸法測定[14]；相對電導率采用電解質外滲法測定[15]；超氧化物歧化酶（SOD）活性測定采用Giannopolitis等[16]的方法測定；過氧化氫酶（CAT）活性采用Aebi[16]的方法；可溶性蛋白含量采用考馬亮斯藍G-250法測定[17]。

1.3 數據分析 采用Office 2010軟件對數據進行處理和繪圖，數據用“平均值±標準誤”表示，采用DPS統計分析軟件對數據進行差異顯著性檢驗，取P<0.05為顯著相關，各項指標測定重復3次。

2 結果與分析

2.1 銅離子脅迫對藜麥種子的萌發、株高和主根長的影響 發芽率是衡量種子質量好壞的重要指標，種子能否正常發芽是生長的先決條件[9]。由表1可知，隨著Cu2+濃度的升高，藜麥種子的發芽率、發芽勢、發芽指數及活力指數均呈現逐漸下降的趨勢，除50μmol/L與100μmol/L Cu2+濃度處理下，發芽率與發芽勢變化差異不顯著外，其余各處理間變化差異顯著（P<0.05）。低濃度Cu2+（0～100μmol/L）對藜麥種子的發芽率和發芽勢無明顯的影響，而高濃度Cu2+（150～200μmol/L）則明顯抑制了種子的發芽。當濃度升高到150μmol/L時，藜麥種子發芽率明顯降低，為對照的91.3%，發芽個數達到供試種子的50%以上，當Cu2+濃度增加到200μmol/L時，藜麥種子的發芽率、發芽勢、發芽指數和活力指數顯著降低，僅為對照的85.8%。在銅離子濃度大于50μmol/L時能夠明顯的抑制藜麥主根的生長，當銅離子濃度大于100μmol/L時能夠明顯的抑制植株的生長。

2.2 銅離子脅迫對藜麥幼苗超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性的影響

2.2.1 銅離子脅迫對藜麥幼苗過氧化氫酶（CAT）活性的影響 在植物體中，黃素氧化酶類的代謝產物常包含H2O2，而H2O2的積累可導致破壞性的氧化作用，而過氧化物酶可以清除H2O2，是植物體內重要的活性氧清除系統之一。如圖1所示：在銅離子濃度低于100μmol/L時，其CAT的活性與對照組相比沒有明顯的提高，在高于100μmol/l時CAT的活性隨著銅離子濃度的增加而增加。

2.2.2 銅離子脅迫對藜麥幼苗超氧化物歧化酶（SOD）的影響 超氧化物歧化酶（SOD）是一種具有抗氧化、抗衰老、抗輻射和消炎作用的藥用酶。它可以催化超氧負離子（O2-）進行歧化反應，生成氧和過氧化氫：2O2-+H2→O2+H2O2。如圖2所示：在銅離子濃度低于50μmol/L其SOD的活性與對照組相比沒有明顯的增加，而在50～150μmol/L，其活性有明顯的增加，相比對照組增加了63.2%，在高于150μmol/L時，其活性增長變緩。

2.3 銅離子脅迫對藜麥幼苗體內可溶性蛋白含量的影響

2.3.1 牛血清蛋白標準曲線 按表1進行操作，待5min后在595nm的波長處測定吸光值，以A595吸光值為縱坐標，牛血清蛋白的數量為橫坐標繪制標準曲線，如圖3所示。

2.3.2 銅離子脅迫對藜麥幼苗體內可溶性蛋白含量的影響 植物在遭受逆境脅迫時，會改變一些蛋白質的表達，其中在重金屬脅迫的條件下會新合成大量的蛋白質以適應環境生長。表3為不同濃度銅離子脅迫下藜麥幼苗體內可溶性蛋白的測定值。如圖4所示：在銅離子濃度小于150μmol/L其幼苗體內的可溶性蛋白含量與對照組相比有明顯的影響，在銅離子濃度為150μmol/L時，其可溶性蛋白含量增加了53.4%；當銅離子濃度在150～200μmol/L，其可溶性蛋白含量增加逐漸變緩。

2.4 銅離子脅迫對藜麥幼苗質膜的透性以及丙二醛（MDA）含量的影響

2.4.1 銅離子脅迫對藜麥幼苗質膜透性的影響 植物細胞膜對維持細胞的微環境和正常代謝起著重要作用。逆境（如重金屬）脅迫強度與膜透性增大的程度有關。表4為不同濃度銅離子脅迫對藜麥幼苗質膜相對電導率的測定值。如圖5所示：在銅離子濃度50μmol/L時，其質膜的相對電導率沒有明顯的變化，這說明在此濃度條件下，對細胞膜的損壞程度較低，而在銅離子濃度大于50μmol/L時，其相對電導率隨著銅離子濃度的增加而逐漸增加，說明在濃度為200μmol/L時，細胞質膜受損程度較大。

2.4.2 銅離子脅迫對藜麥幼苗體內丙二醛（MDA）含量的影響 MDA是細胞膜脂質過氧化的產物之一，其含量高低可反應細胞膜脂質過氧化的水平和膜受傷害的程度。表5為不同濃度銅離子脅迫下藜麥幼苗體內丙二醛含量的測定值。如圖6所示：在銅離子濃度50μmol/L時，其藜麥幼苗體內丙二醛（MDA）含量沒有明顯的變化，說明在此濃度條件下，細胞膜膜脂的氧化程度較低并且質膜的損壞程度較低，而在銅離子濃度大于50μmol/L時，其MDA的含量隨著銅離子濃度的增加而逐漸增加，說明在濃度為200μmol/L時，細胞膜的膜脂氧化程度較大并且質膜受損程度較大。

3 結論與討論

由本試驗研究可知，銅離子對藜麥的正常生長影響顯著，隨著營養液中銅濃度的升高，藜麥幼苗體內可溶性蛋白含量、丙二醛含量、超氧化物歧化酶活性和過氧化物酶活性以及葉片的相對電導率呈上升趨勢，其原因主要為：銅離子的脅迫對藜麥的保護系統造成了一定的損傷，使細胞膜過度氧化，并且丙二醛作為細胞膜氧化的主要產物，因此其含量增加；在正常狀態下，細胞膜的電導率是一定的，由于細胞膜的破壞，細胞膜的通透性發生了改變，如：K+的大量外流，使細胞膜的相對電導率增加；由于不同濃度的銅離子在脅迫藜麥幼苗時使細胞膜過度氧化，為了防止其氧化細胞自身，使其體內過氧化氫酶和超氧化物歧化酶的活性大大增加，從而抑制細胞膜的氧化，同時可溶性蛋白的含量也隨之增加。

主根長下降的趨勢大于株高下降趨勢，其具體原因未知，原因可能為：由于根長時間接觸含有不同濃度銅離子的營養液，使其受到的抑制要大于地上部分；根對銅離子的敏感性要大于地上部分；根的保護系統沒有葉片的保護系統發達，在銅離子脅迫時根的損害程度大于地上部分。

今后，除加強對“三廢”和不合格農藥、化肥的監測外，還應該在藜麥栽培上，對已發生銅污染的農田，采取科學施用化肥、農藥，適當增施有機肥料、無土栽培等措施，盡力創造適宜藜麥生長發育的環境，使其在較多環境中生存，用來解決糧食問題，并給農民帶來豐厚的收入。

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（責編：張宏民）