黑木耳中水溶性多糖提取條件的研究

李睿瑞 唐金敏 趙行建 婁旗輝 楊帆 韓如月 劉淑霞 荊瑞勇 王麗艷

摘 要：目的：優化黑木耳中多糖的提取工藝條件，明確黑木耳多糖的抑菌活性。方法：采用單因素試驗和正交試驗，研究提取時的液料比、提取時間和提取溫度對黑木耳多糖提取率的影響。結果：提取溫度是影響黑木耳多糖提取率的最關鍵因素，其次是提取時間，液料比對多糖提取率的影響最小。結論：黑木耳多糖最佳提取條件為液料比30，提取時間4h，提取溫度95℃。在最佳提取條件下，黑木耳多糖提取率為5.16%。

關鍵詞：黑木耳；多糖；提取條件；正交試驗

中圖分類號 S646.6 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2018）11-0009-03

黑木耳[Auricularia auricular（L.ex Hook.） Underwrd.]又稱木耳，屬擔子菌綱（Basidiomycetes），木耳目Auriculariales，木耳科Auriculariaceae[1]。中國是黑木耳的主要生產國，產區主要分布在吉林、黑龍江、遼寧、內蒙古、廣西、云南、貴州、四川、湖北、陜西等地，其中黑龍江省牡丹江地區海林市是中國最大的黑木耳基地，產出的黑木耳品質在全國名列前茅[2]。目前國內黑木耳有9個品種[3]，黑龍江地區有其中的8個品種。黑木耳多糖具有抗血栓[4]、抗凝血[5]、增強機體免疫功能[6]等多種有益于人體健康的功效，其含有豐富的甘露聚糖、葡萄糖、甘露糖、木糖、葡萄糖醛酸等碳水化合物[7，8]，是菌中之佳品。本文利用正交試驗法，對黑木耳多糖的提取條件的優化及粗多糖含量的測定進行了研究。

1 材料、試劑與儀器

1.1 材料和試劑 供試黑木耳，黑龍江八一農墾大學生命科學技術學院食用菌研究室選育。將黑木耳用粉碎機粉成粉末狀態，過60目篩，保存備用。葡萄糖、正丁醇、氯仿、無水乙醇、濃硫酸、苯酚、活性炭等化學試劑均為分析純。

1.2 儀器 V-1000型可見分光光度計（翱世儀器（上海）有限公司）、TDZ5-WS低速大容量離心機（湘儀離心機儀器有限公司）、DK-8D三濕三控水槽（上海博迅實業有限公司醫療設備廠）、AR153CN電子天平（奧豪斯儀器（常州）有限公司）、DGG-9140A型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海森信實驗儀器有限公司）、SZC-101智能型自動提取索氏提取器（上海纖檢儀器有限公司）等。

2 實驗方法

2.1 標準曲線的繪制 精密稱取105℃下烘干至恒重的葡萄糖10mg，用蒸餾水溶解定容至100mL。精密吸取葡萄糖溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL于10mL具塞試管內，補充蒸餾水至2.0mL，搖勻，另取1支具塞試管加入2.0mL蒸餾水作為對照。各試管加入6%苯酚溶液1.0 mL，搖勻，迅速加入濃硫酸5.0mL，混合均勻，室溫放置25min，于490nm波長處測定吸光度。

2.2 黑木耳多糖的提取及純化 將黑木耳粉裝入濾紙包中，用SZC-101智能型自動提取索氏提取器除去脂肪，于40℃烘箱中烘干。稱取黑木耳粉1.00g，以0.3mol/L的NaOH溶液作為溶劑，采用不同的液料比、不同溫度、不同提取時間對黑木耳樣品進行多糖的提取。完成浸提后于3000r/min離心10min，用5.0mol/L的鹽酸調節上清液 pH至中性，濾液95℃下水浴濃縮至10mL，加入3倍體積的95%乙醇（30mL），靜置過夜。3000r/min離心10min，收集沉淀，加50mL水復溶后，取出20mL向其中加入5 mL sevage試劑（氯仿∶正丁醇=4∶1），振蕩后靜置分離，直到沒有乳白色變性蛋白析出為止，收集分液漏斗中的上清液，向上清液中加入足量的活性炭，搖勻，恒溫30min以上，過濾；取0.05mL過濾液加蒸餾水至2mL，于490nm下進行分光光度的測定。

2.3 多糖含量測定 黑木耳多糖含量測定采用苯酚-硫酸顯色法[9]，具體操作同標準曲線。

2.4 單因素試驗設計 精確稱取樣品1.00g置于100mL三角瓶中，考察液料比對多糖得率的影響，液料比分別為10、20、30、40、50，提取溫度為85℃，提取時間為2h，提取1次，3次重復；考察提取時間對多糖得率的影響，提取時間分別為1h、2h、3h、4h、5h，液料比為30，提取溫度為85℃，提取1次，3次重復；考察提取溫度對多糖得率的影響，提取溫度分別為55℃、65℃、75℃、85℃、95℃，液料比為30，提取時間為2h，提取1次，3次重復，按照2.2方法操作。

2.5 正交試驗設計 擬采用正交試驗設計優化黑木耳多糖提取條件，根據單因素的試驗結果，選擇液料比、提取時間、提取溫度為影響因素，進行3因素3水平的正交試驗設計，見表1。

3 結果與分析

3.1 標準曲線的制作 按照2.1進行實驗操作，以葡萄糖量為橫坐標，以A490為縱坐標，繪制標準曲線如圖1所示。回歸方程：y=0.0064x+0.0106，R2=0.9955。

3.2 單因素試驗

3.2.1 液料比對黑木耳多糖提取率的影響 準確稱量1.00g黑木耳干粉，液料比分別為10、20、30、40、50，提取溫度為85℃，提取時間為2h，提取1次，3次重復。按照2.2的方法進行操作，結果見圖2。由圖2可知，黑木耳多糖提取率隨著液料比的增加而呈現先增加而后稍有下降的趨勢，液料比為30時多糖提取率達到最大值。從方差分析可知，當液料比為30時多糖提取率與液料比40和50無顯著性差異，但顯著高于液料比20和10。因此選取液料比20、30和40進行后續的正交試驗。

3.2.2 提取時間對黑木耳多糖提取率的影響 準確稱量1.00g黑木耳干粉，提取時間分別為1h、2h、3h、4h、5h，液料比為30，提取溫度為85℃，提取1次，3次重復。按照2.2的方法進行操作，結果見圖3。由圖3可知，黑木耳多糖提取率隨著提取時間的增加而呈現逐漸增加的趨勢，提取時間為5h時達到最大值。從方差分析可知，提取時間為5h與4h時，多糖提取率之間無顯著性差異，與1h、2h和3h之間差異顯著。因此選取提取時間2h、3h和4h進行后續的正交試驗。