冠突散囊菌發(fā)酵燕麥對阿魏酸含量的影響

劉善鑫，劉素純，2*，李再貴

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128；3.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

燕麥（Avenasatival）屬禾本科（Poaceae）、燕麥屬（Avena），是集糧、經(jīng)、飼、藥等多用途于一身的作物[1]。燕麥中含有豐富的抗氧化成分（如黃酮類、多酚類化合物、維生素E等）及其特有的恩酰胺物質(zhì)，多酚類化合物中含量較多的是阿魏酸、對香豆酸和兒茶酚[2-5]。多酚類化合物在預(yù)防心血管疾病上有顯著功效[6]。阿魏酸是公認(rèn)的天然抗氧化劑—阿魏酸桂皮酸的衍生物之一[7]，其主要功能有抗氧化性、降血脂、抗血栓、抗癌等[8-11]。

冠突散囊菌（Eurotium cristatum）在茯磚茶中俗稱“金花”。洛伐他汀是典型的冠突散囊菌發(fā)酵而來的次生代謝產(chǎn)物，其含有豐富的降脂類物質(zhì)，對高血壓、高血脂有一定的治療效果[12-16]。王家琛等[17]發(fā)現(xiàn)冠突散囊菌固態(tài)發(fā)酵燕麥能夠顯著提升多酚含量，MASISIK等[18-19]研究發(fā)現(xiàn)，固體發(fā)酵能激發(fā)燕麥中多酚類物質(zhì)的抗氧化能力。國內(nèi)外有很多研究人員利用微生物發(fā)酵研發(fā)新產(chǎn)品[20-22]，本研究擬采用冠突散囊菌固態(tài)發(fā)酵燕麥，以期提高其阿魏酸含量，為燕麥的開發(fā)提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

裸燕麥：黑龍江黑土香燕麥產(chǎn)業(yè)股份有限公司；冠突散囊菌（Eurotium cristatum）：從湖南安化白沙溪茶廠的茯磚茶分離。

阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品：上海紫一試劑廠；無水乙醇、乳酸、甲醇、冰醋酸（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DGG-9070A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海森信實驗儀器有限公司；SPX-25085-Ⅱ生化培養(yǎng)箱：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；FW135中草藥粉碎機：天津市泰斯特儀器有限公司；XMTD數(shù)顯恒溫水浴鍋：上海浦東物理光學(xué)儀器廠；RXⅡSeries高速低溫冷凍離心機：HITACHI；Waters 2695型高效液相色譜儀（highperformanceliquidchromatography，HPLC）：美國沃特世公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 發(fā)酵燕麥樣品前處理

稱取100g去雜去劣的裸燕麥，加入200mL水浸泡12h。將水瀝干，121℃滅菌25 min。接入1%冠突散囊菌發(fā)酵劑，搖勻，于28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 d。將發(fā)酵后的燕麥于45℃烘箱烘干10 h，粉碎，過40目篩，得到發(fā)酵的燕麥粉，置4℃陰涼處保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 阿魏酸含量測定的色譜條件

VenusilXBPC1（84.6×250mm，5μm）色譜柱，波長314nm，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，柱溫30 ℃，流動相為甲醇-1.0%冰醋酸（28∶72，V/V）。

1.3.3 燕麥阿魏酸提取條件優(yōu)化

單因素試驗：10 g燕麥粉加入乙醇，置于恒溫水浴鍋中提取一定時間，于4℃條件下10 000 r/min離心10 min。上清液用0.22μm膜過濾，按上述色譜條件進(jìn)行HPLC測定。分別考察不同提取溫度（40℃、50℃、60℃、70℃、80℃），不同提取時間（5 h、6 h、7 h、8 h、9 h），不同固液比（燕麥粉∶體積分?jǐn)?shù)60%乙醇）（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g∶mL）），不同乙醇體積分?jǐn)?shù)（40%、50%、60%、70%、80%）對燕麥阿魏酸含量的影響。

為確定燕麥阿魏酸各提取因素的最佳值，在單因素試驗基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對阿魏酸提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，選擇4因素3水平設(shè)計正交試驗，燕麥阿魏酸提取條件優(yōu)化正交試驗因素與水平見表1。

表1 燕麥阿魏酸提取條件優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for ferulic acid extraction conditions optimization from oat

1.3.4 冠突散囊菌發(fā)酵燕麥條件優(yōu)化

單因素試驗：分別考察不同發(fā)酵溫度（24℃、26℃、28 ℃、30℃、32 ℃），不同浸泡液pH值（4、5、6、7、8），不同接種量（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%），不同發(fā)酵時間（2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d、8 d）對燕麥發(fā)酵的影響，并測定其阿魏酸含量。

為確定燕麥各發(fā)酵因素的最佳值，進(jìn)一步對冠突散囊菌發(fā)酵燕麥條件進(jìn)行優(yōu)化，選擇4因素3水平設(shè)計正交試驗，燕麥發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗因素與水平見表2。

表2 燕麥發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of orthogonal experiments for oat fermentation conditions optimization

2 結(jié)果與分析

2.1 燕麥阿魏酸提取條件優(yōu)化

2.1.1 提取溫度對燕麥阿魏酸含量的影響

圖1 提取溫度對燕麥阿魏酸含量的影響Fig.1 Effect of extraction temperature on ferulic acid content of oat

由圖1可知，隨著提取溫度的升高，燕麥阿魏酸含量呈先上升后下降的趨勢。阿魏酸含量先上升可能是因為加熱后可提高其溶解度；當(dāng)提取溫度達(dá)到60℃時，燕麥阿魏酸含量最高，為169.21 μg/g；提取溫度超過60℃時，燕麥阿魏酸含量降低，原因可能是溫度過高會對阿魏酸的結(jié)構(gòu)有一定的破壞作用[23]。因此選擇提取溫度60℃為宜。

2.1.2 提取時間對燕麥阿魏酸含量的影響

圖2 提取時間對燕麥阿魏酸含量的影響Fig.2 Effect of extraction time on ferulic acid content of oat

由圖2可知，隨著提取時間的延長，燕麥阿魏酸提取含量呈先上升后下降趨勢。阿魏酸含量先上升可能是因為5 h未提取完全；當(dāng)提取時間為6 h時燕麥阿魏酸含量最高，為187.56 μg/g；之后繼續(xù)延長提取時間，阿魏酸含量減少，原因可能是阿魏酸穩(wěn)定性較差，提取時間過長容易導(dǎo)致阿魏酸發(fā)生還原反應(yīng)[24]。因此選擇提取時間6 h為宜。

2.1.3 固液比對燕麥阿魏酸含量的影響

圖3 固液比對燕麥阿魏酸含量的影響Fig.3 Effect of different solid-liquid ratio on the content of ferulic acid in oat

由圖3可知，隨著固液比的升高，燕麥阿魏酸含量呈先上升后下降趨勢。阿魏酸含量先上升可能是因為提取溶劑較少，不易完全提取阿魏酸；當(dāng)固液比為1∶15（g∶mL）時提取的阿魏酸含量最高，為173.58 μg/g；之后阿魏酸含量降低，原因可能是提取溶劑用量太大，一方面會使得溶液濃縮時能耗增大，另一方面會使得釋放出的阿魏酸在后續(xù)處理過程中更易受到氧化作用而被破壞[25]。因此選擇固液比1∶15（g∶mL）為宜。

2.1.4 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對燕麥阿魏酸含量的影響

圖4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對燕麥阿魏酸含量的影響Fig.4 Effect of different ethanol concentration on ferulic acid content of oat

由圖4可知，在一定范圍內(nèi)，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，燕麥阿魏酸含量呈先上升后下降趨勢。阿魏酸含量先上升可能是因為隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，溶劑極性減小，有利于阿魏酸的溶解；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到60%時，燕麥阿魏酸含量達(dá)到最高，為188.5 μg/g；之后繼續(xù)增加乙醇體積分?jǐn)?shù)，提取含量反而減少，原因可能是乙醇體積分?jǐn)?shù)過高，脂溶性雜質(zhì)溶出增多，不利于阿魏酸溶解[26]。因此選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)60%為宜。

2.1.5 燕麥阿魏酸提取條件最佳組合的確定

表3 燕麥阿魏酸提取條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for ferulic acid extraction conditions optimization from oat

由表3可知，各因素對阿魏酸含量影響的主次順序為A（提取溫度）＞B（提取時間）＞C（固液比）＞D（乙醇體積分?jǐn)?shù)），直觀分析阿魏酸提取最優(yōu)水平組合為A1B1C1D1，而通過極差分析最優(yōu)水平組合為A1B1C1D3，驗證試驗結(jié)果表明，燕麥阿魏酸最佳提取條件為A1B1C1D1，即浸提溫度為50 ℃，提取時間為6 h，固液比為1∶10（g∶mL），乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%。在此條件下，燕麥阿魏酸平均含量為197.25μg/g。

2.2 燕麥發(fā)酵條件優(yōu)化

2.2.1 發(fā)酵溫度對發(fā)酵燕麥阿魏酸含量的影響

圖5 發(fā)酵溫度對發(fā)酵燕麥阿魏酸含量的影響Fig.5 Effect of fermentation temperature on ferulic acid contents of fermented oat

由圖5可知，溫度對發(fā)酵燕麥的阿魏酸含量的影響較大，隨著溫度的升高，阿魏酸含量呈先上升后平緩的趨勢。當(dāng)發(fā)酵溫度為30℃時，阿魏酸含量最高為430.19 μg/g，說明冠突散囊菌在30℃發(fā)酵時生長較好，酶活性較高，生物化學(xué)反應(yīng)加快，產(chǎn)生了更多的代謝產(chǎn)物，能夠積累更多的阿魏酸；當(dāng)溫度為24℃和32℃時，可能是溫度限制了冠突散囊菌對阿魏酸酯酶的釋放，影響了冠突散囊菌酶活性，從而對阿魏酸的轉(zhuǎn)化起到了一定的抑制因素[27]。因此選擇發(fā)酵溫度30℃為宜。

2.2.2 浸泡液pH值對發(fā)酵燕麥阿魏酸含量的影響

圖6 浸泡液pH值對發(fā)酵燕麥阿魏酸含量的影響Fig.6 Effect of different pH value of substrates on ferulic acid contents of fermented oat

由圖6可知，隨著浸泡液pH值的升高，阿魏酸含量呈先上升后下降的趨勢，pH值為4～6時，阿魏酸含量逐漸升高；浸泡液pH值為6時，發(fā)酵燕麥中阿魏酸含量最高，為437.16μg/g；當(dāng)pH值為7～8時，阿魏酸含量較低，由此可見偏酸適合冠突散囊菌生長產(chǎn)阿魏酸酯酶，理論上，與霉菌生長的條件要求相符。因此選擇浸泡液pH 6為宜。

2.2.3 接種量對發(fā)酵燕麥阿魏酸含量的影響

圖7 接種量對發(fā)酵燕麥阿魏酸含量的影響Fig.7 Effect of different inoculum on ferulic acid contents of fermented oat

由圖7可知，隨著接種量的增加，阿魏酸含量呈先上升后下降的趨勢。接種量為0.5%～1.5%時，阿魏酸含量逐漸增加，在接種量為1.5%時達(dá)到最高，為440.95 μg/g；繼續(xù)增加接種量，阿魏酸含量開始下降，可能是因為接種量過大，冠突散囊菌對基質(zhì)的營養(yǎng)進(jìn)行競爭，從而影響結(jié)合態(tài)的阿魏酸轉(zhuǎn)化為游離態(tài)的阿魏酸[17]。因此選擇接種量1.5%為宜。

2.2.4 發(fā)酵時間對燕麥阿魏酸含量的影響

圖8 發(fā)酵時間對發(fā)酵燕麥阿魏酸含量的影響Fig.8 Effect of different fermentation time on ferulic acid content of fermented oat

由圖8可知，隨著發(fā)酵時間的延長，阿魏酸含量呈先上升后下降的趨勢，在第4天達(dá)到最高，為834.02μg/g。大量研究表明，燕麥在經(jīng)過微生物發(fā)酵后，抗氧化活性顯著增加，可能是因為冠突散囊菌在經(jīng)過生長繁殖過程中進(jìn)行了細(xì)胞壁的裂解及酶促反應(yīng)，產(chǎn)生了大量的代謝產(chǎn)物，使得酚類如阿魏酸不斷累積增加，從而讓燕麥阿魏酸含量不斷增加[28]；而后開始下降，冠突散囊菌又以阿魏酸為其呼吸的碳源，從而導(dǎo)致阿魏酸含量下降[29]。因此選擇發(fā)酵時間4 d為宜。

2.2.5 燕麥發(fā)酵條件最佳組合的確定

表4 燕麥發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 4 Results and analysis of orthogonal experiments for oat fermentation conditions optimization

由表4可知，各因素中對發(fā)酵燕麥阿魏酸含量影響的主次順序為E（發(fā)酵溫度）＞F（浸泡液pH值）＞G（接種量），直觀分析阿魏酸含量最優(yōu)水平組合為A1B2C2；而通過極差分析最優(yōu)水平組合為A1B1C2。驗證試驗結(jié)果表明，發(fā)酵燕麥阿魏酸含量最優(yōu)水平組合為A1B2C2，即發(fā)酵溫度為26℃，浸泡液pH值為5，接種量為1%，在此條件下，發(fā)酵燕麥阿魏酸平均含量為454.29 μg/g。在該最佳條件下發(fā)酵4 d，發(fā)酵燕麥阿魏酸含量為835.89 μg/g，是未發(fā)酵的4.2倍。

3 結(jié)論

微生物的發(fā)酵過程較為復(fù)雜，在生長過程中會受到pH、溫度等多種因素的影響，冠突散囊菌固態(tài)發(fā)酵燕麥會影響到燕麥中阿魏酸的含量；本研究以HPLC法測定發(fā)酵燕麥中的阿魏酸含量，發(fā)現(xiàn)冠突散囊菌發(fā)酵燕麥能夠提升其阿魏酸含量，確定了燕麥阿魏酸的最佳提取條件為采用固液比為1∶10（g∶mL）的體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇在50 ℃條件下浸提發(fā)酵燕麥6 h。冠突散囊菌發(fā)酵燕麥的最佳條件為裸燕麥在pH5的水溶液中浸泡12 h，121℃滅菌后接種1%的冠突散囊菌，26℃恒溫發(fā)酵，發(fā)酵第4天時阿魏酸含量達(dá)到最高，為835.89 μg/g，是未發(fā)酵的4.2倍。燕麥作為一種高營養(yǎng)物質(zhì)，微生物發(fā)酵能夠得到富含功能營養(yǎng)物質(zhì)的發(fā)酵燕麥，但內(nèi)在的生物轉(zhuǎn)化機理有待進(jìn)一步研究。

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