白酒關鍵微量成分對醉度及小鼠乙醇代謝和急性酒精性肝損傷的影響

謝 佳，彭 斌，何松貴，衛云路，吳振強*

（1.華南理工大學 生物科學與工程學院，廣東 廣州 510006；2.廣東省九江酒廠有限公司，廣東 佛山 528203）

中國白酒是世界六大蒸餾酒之一，深受廣大消費者喜愛[1]。隨著物質文化生活的不斷提高，人們對白酒品質提出了更高的標準，要求飲酒后既有好的享受，又不影響健康[2]，因此低醉度白酒的生產調控及白酒醉度評價標準的建立與應用具有重要意義[3]。

白酒醉度的評價方法主要以小鼠模型為基礎，將酒樣與同濃度純酒精灌胃小鼠作對比，結合小鼠飲酒后的行為和生化指標進行評價。鄭露等[4-5]以小鼠飲酒后翻正反射消失和恢復試驗作為判斷醉酒和醒酒的方法，對比了酒樣和同濃度純酒精的醉酒時間和醒酒時間，建立了較為準確的白酒醉度評價動物模型；彭彥卿等[6]利用已建立的白酒醉度評價動物模型對比飲用不同醉度濃香型白酒后小鼠血液和肝臟生化的指標差異，結合病理組織學檢查，發現低醉度白酒對小鼠酒精性肝損傷的程度低于高醉度白酒；鄭露等[4]比較了不同醉度濃香型白酒灌胃后小鼠血液乙醇和乙醛的代謝變化，發現飲用醉度低的白酒后小鼠血液乙醇代謝更快。WUZQ等[7]按酒精梯度劑量灌胃小鼠酒液，結合飲酒后血液乙醇生化指標和游泳、跑動能力及翻正反射行為指標，建立了科學、快速的白酒綜合醉度（intoxicating degree，ID）動物評價模型。本研究將利用該白酒綜合醉度小鼠評價模型對配制豉香型新酒和陳酒進行評價比較，結合乙醇代謝和急性酒精性肝損傷分析，探索白酒關鍵微量成分對醉度的影響，及醉度與乙醇代謝和傷肝的關系，為低醉度白酒的生產和應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗小鼠（雄性昆明小鼠，SPF級，體質量18～22g）：由南方醫科大學提供，實驗動物許可證號，SCXK（粵）2016-0041，實驗單位使用許可證號，SYXK（粵）2012-0125。

29.5 %vol新酒和33.5%vol陳酒（6年陳）：廣東省九江酒廠有限公司。兩種白酒關鍵微量成分見表1。

表1 2種豉香型白酒中關鍵微量成分Table 1 Key microconstituents in two kinds of Chi-flavorBaijiu mg/L

無水乙醇、叔丁醇、白酒關鍵微量成分標準品（除L-乳酸為純度90%外，其余純度均＞95%）：上海晶純生化科技股份有限公司；肝素鈉（≥180 USP/mg）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）、乙醛脫氫酶（acetaldehyde dehydrogenase，ALDH）、谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malonaldehyde，MDA）、總蛋白定量測定試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

SpectraMax M5多功能酶標儀：美國Thermo Fisher Scientific公司；UV-2802S型紫外可見分光光度計：上海尤尼柯儀器有限公司；GC-2014C氣相色譜分析儀：日本島津公司；5804R冷凍離心機：德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 關鍵微量成分缺失配制酒的制備

根據表1中33.5%vol陳酒的關鍵微量成分，減除某種物質或某一類成分，配制成相應酒精度相同的關鍵微量成分配制酒（簡稱配制酒）酒樣，用于后續酒樣醉度評價和小鼠乙醇代謝及急性肝損傷研究，配制酒缺失的成分和標識如表2所示。

表2 配制酒缺失成分與編號標識Table 2 Ingredients deficiency from the formulated liquor and number identification

1.3.2 酒樣醉度評價

酒樣的綜合醉度評價：按照WU Z Q等[7]報道的方法：小鼠適應性喂養一周，期間每天進行翻正反射、游泳和跑滾筒3項行為能力訓練；按每個酒樣6只小鼠隨機分組，每組按照6個乙醇梯度劑量（0.356 g/100、0.435 g/100、0.514g/100、0.593g/100、0.672g/100、和0.751g/100g體質量）灌胃酒液，每只小鼠灌胃一個劑量，0.5 h和2.0 h后分別依次進行翻正反射、跑滾筒1 min、游泳1 min 3項行為能力測試；每次行為能力測試后采用尾部取血100μL，加入500μL乙腈、50 μL的500 mg/L叔丁醇內標溶液、10 μL肝素鈉溶液和340 μL水，混勻后12 000 r/min離心10 min，上清液過0.22 μm有機濾膜后進氣相測定血液乙醇含量。

酒樣醉度評價：按照WU Z Q等[7]報道的方法計算酒樣醉度，醉度值（intoxicating degree，ID）＞1說明酒樣醉度高于同濃度的酒精溶液，ID越大，酒樣醉度越高。

1.3.3 乙醇代謝小鼠模型分析[8]

小鼠隨機分組，每組5只，各組按乙醇劑量4 g/kg體質量用表2成分缺失酒樣灌胃，2 h后各組小鼠先采用摘眼球法取血，再采用頸椎脫臼法處死，取肝臟。

血液乙醇、乙醛測定：血樣用肝素鈉抗凝后取血漿200 μL，加入600 μL乙腈，混合后12 000 r/min離心10 min，收集上清液500 μL，加入480 μL乙腈和20 μL 1 mg/mL叔丁醇內標溶液，混勻后過0.22 μm有機濾膜，濾液進氣相測定乙醇、乙醛含量。氣相色譜條件：WondaCap WAX色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）進樣口溫度250℃，火焰離子化檢測器（flame ionization detector，FID）溫度250℃，程序升溫，初始溫度48℃，3℃/min升溫至55℃，再以30℃/min升溫至200℃，保持2min。柱流量1.5mL/min，分流進樣，分流比20∶1，進樣量1 μL。

肝臟ADH、ALDH檢測：肝臟用4℃生理鹽水洗去血水，濾紙吸干后稱取0.1 g肝組織，用預冷生理鹽水制成10%組織勻漿，4℃條件下3 000 r/min離心15 min，收集上清，按試劑盒說明測定ADH、ALDH活性和樣品總蛋白含量。

1.3.4 急性酒精肝損傷小鼠模型分析[8]

小鼠隨機分組，每組5只，各組按乙醇劑量6 g/kg體質量用表2成分缺失酒樣灌胃，6 h后各組小鼠先采用摘眼球法取血，再采用頸椎脫臼法處死，取肝臟。

血清ALT、AST檢測：血樣室溫靜置1 h，4℃條件下6000r/min離心10 min，收集上清，按試劑盒說明測定ALT、AST活性。

肝臟SOD、MDA檢測：肝臟用4℃生理鹽水洗去血水，濾紙吸干后精確稱取0.1g肝組織，用預冷生理鹽水制成10%組織勻漿，4℃條件下3 000 r/min離心15 min，收集上清，按試劑盒說明測定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性、丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量和樣品總蛋白含量。

2 結果與分析

2.1 新酒、老酒及相應模擬酒的綜合醉度

模擬表1中29.5%vol新酒、33.5%vol陳酒（6年陳）的主要成分構成，以酒精制成相應酒精溶液，利用白酒綜合醉度小鼠評價模型進行評價，4種酒樣的綜合醉度和醉度評價如圖1所示。

圖1 2種豉香型白酒及對應配制酒對小鼠綜合醉酒度（A）和醉度（B）的影響Fig.1 Effect of two kinds of Chi-flavorBaijiuand corresponding formulated liquor on comprehensive drunkenness degree(A)and intoxicating degree(B)of mice

由圖1A可知，6個酒精梯度劑量條件下，酒樣綜合醉度線性關系良好，33.5%vol陳酒綜合醉度比29.5%vol新酒要低，兩種酒精溶液綜合醉度都高于相應酒精度的白酒；由圖1B可知，對比4種酒樣醉度，酒精溶液（29.5%vol、33.5%vol）與新酒（29.5%vol）的醉度差異不大，但陳酒（33.5%vol）的醉度顯著低于酒精溶液（29.5%vol、33.5%vol）（P＜0.01）。結合表1中新酒和陳酒的關鍵微量成分來看，這可能是因為經過多年陳化過程，酒中的物質成分發生變化，酒體結構更加趨于平衡協調，因而能減輕酒中有害物質對機體的傷害[9]。此外，在酒的陳化過程中，醇水締合作用被認為也可以減緩飲酒后乙醇的吸收，降低乙醇對機體的刺激程度[10]。

對比兩種酒精溶液的關鍵微量成分和醉度差異發現，33.5%vol酒精溶液因其關鍵微量成分與陳酒基本一致，對應醉度要比29.5%vol酒精溶液稍低，故選擇33.5%vol酒精溶液為后續關鍵微量成分缺失試驗用酒。

2.2 關鍵微量成分缺失對白酒醉度的影響

近年來，國內學者對白酒風味成分進行了重組，結合組分缺失試驗研究了關鍵微量成分對白酒風味的影響[11-12]。本研究借鑒此研究手段，模擬表1中33.5%vol陳酒的關鍵微量成分構成，減除某種物質或某一類成分，制備得酒精度相同的配制酒，以此來研究不同組分對醉度的貢獻，實驗結果如圖2所示。

圖2 缺失不同成分的配制酒醉度Fig.2 Intoxicating degree of formulated liquors with different ingredient deficiency

由圖2可知，與未缺失成分酒樣A相比，缺失酸類成分后配制酒B、B-1、B-2的醉度都升高，其中缺失乙酸的B-1酒樣極顯著升高（P＜0.01），而缺失乳酸的B-2酒樣升高但不顯著；缺失酯類成分后，配制酒C、C-1、C-2的醉度都升高，其中缺失乙酸乙酯的C-1酒樣顯著升高（P＜0.05），而缺失乳酸乙酯的C-2酒樣升高但不顯著；缺失雜醇類成分后，配制酒D、D-1、D-2、D-3配制酒的醉度都降低，其中缺失異戊醇的D-3酒樣極顯著降低（P＜0.01），缺失異丁醇的D-2酒樣顯著降低（P＜0.05），而缺失正丙醇的D-1酒樣降低但不明顯。

缺失不同成分的配制酒醉度的對比分析結果表明，酸類中乙酸和酯類中乙酸乙酯的缺失將引起酒樣醉度明顯升高，說明乙酸和乙酸乙酯可以起到降低白酒醉度的作用。事實上，研究報道證實合適的乙酸和乙酸酯含量可以通過激活肝臟5'-一磷酸腺苷（adenosine 5'-monophosphate，AMP）依賴的蛋白激酶（adenosine5'-monophosphate（AMP）-activated protein kinase，AMPK）活性[13-15]或上調內皮一氧化碳合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）活性[16]來介導對機體的保護作用，由此推測酒中乙酸和乙酸乙酯也能起到類似的作用，減小有害物質對機體的損傷，進而降低白酒醉度。然而，雜醇類中異戊醇和異丁醇的缺失將引起酒樣醉度明顯降低，這意味著異戊醇和異丁醇可造成白酒醉度升高。白酒中的雜醇被認為是引起不良醉酒反應潛在的有害物質，可能是通過與乙醇的相互作用[17]或者抑制三羧酸循環[18]進而影響乙醇在體內的代謝，導致代謝有害物積累，最終對機體造成損傷。此外，研究報道顯示酒中雜醇類物質的毒性作用隨碳鏈的增長而增加[19]，這與本實驗條件下缺失正丙醇、異丁醇、異戊醇三種雜醇后酒樣醉度降低幅度的變化趨勢一致。

同時也注意到，圖1中33.5%vol酒精溶液醉度略低于29.5%vol酒精溶液，但對比表1中兩種酒成分，33.5%vol陳酒的乙酸、乳酸、乙酸乙酯和乳酸乙酯含量低于29.5%vol新酒，而異戊醇和異丁醇含量高于29.5%vol新酒，這與圖2得出的結論似乎相矛盾。但從表1也可看出，33.5%vol陳酒比29.5%vol新酒多了幾種酸和酯，推測可能是這些酸酯也起到了降低白酒醉度的作用，這也說明白酒成分越復雜越能起降低醉度的作用，有待進一步進行實驗驗證。

2.3 白酒成分缺失對小鼠乙醇代謝的影響

為探究缺失組分導致酒樣醉度差異的作用機理，實驗分析了灌胃缺失不同組分的配制酒后小鼠乙醇代謝的差異，首先測定并比較了小鼠血液乙醇和乙醛含量，結果如表3所示。

表3 白酒成分缺失對小鼠血液乙醇、乙醛含量的影響Table 3 Effect ofBaijiuingredient deficiency on blood alcohol and acetaldehyde contents

由表3可知，與未缺失成分酒樣相比，缺失酸和酯后小鼠血液乙醇含量都升高，其中乙酸的缺失引起血液乙醇含量極顯著升高（P＜0.01），乙酸乙酯的缺失也造成血液乙醇顯著升高（P＜0.05）；缺失雜醇后，小鼠血液乙醇含量都降低，其中異戊醇的缺失導致血液乙醇和乙醛極顯著降低（P＜0.01），降低幅度高于異丁醇（P＜0.05）。缺失不同成分后血液乙醛的差異與血液乙醇基本相似，并結合圖2分析結果可以得出，酯類和酸類尤其是乙酸的缺失將導致小鼠血液乙醇和乙醛含量升高，造成更大的機體損傷，進而引起醉度升高；雜醇類尤其是異戊醇的缺失將導致小鼠血液乙醇和乙醛含量降低，減小對機體的損傷，進而導致醉度降低。研究顯示，異戊醇及其代謝產物異戊醛在體內的代謝速率相對較慢，而且異戊醛是包括乙醛在內的各種線粒體氧化基質最有效的抑制劑[20]，這表明酒中異戊醇的缺失增加了乙醇代謝的負擔，導致乙醇代謝有害物乙醛在體內積累，造成機體損傷。

表4 白酒成分缺失對小鼠肝臟ADH、ALDH活性含量的影響Table 4 Effect ofBaijiuingredient deficiency on ADH and ALDH activity of liver

由表4可知，與未缺失成分酒樣相比，酸類和酯類成分的缺失并不會引起小鼠肝臟ADH和ALDH酶活性的明顯變化，而雜醇類尤其是異戊醇的缺失，將引起ADH和ALDH酶活性都顯著增強（P＜0.01），如表4所示。結合表3的分析結果來看，配制酒中缺失酸類和酯類成分對肝臟ADH和ALDH酶活性的影響并不能作為其導致血液乙醇和乙醛變化的原因，而缺失雜醇類尤其是異戊醇后肝臟ADH和ALDH酶活性同時增加，是其導致血液乙醇和乙醛含量降低的主要原因。大量研究顯示，除ADH和ALDH外，乙醇代謝系統還涉及過氧化氫酶[21-22]和細胞色素P450 2E1[23-25]的綜合作用，這也意味著血液乙醇和乙醛的含量不完全是由肝臟ADH和ALDH決定的。

2.4 白酒成分缺失對小鼠急性酒精肝損傷的影響

本實驗進一步對小鼠急性肝損傷指標進行了比較分析，一次性灌胃缺失不同成分的配制酒后，小鼠血清ALT和AST活性，以及肝臟SOD活性和MDA含量如表5所示。

表5 白酒成分缺失對小鼠血清ALT、AST及肝臟SOD活性和MDA含量的影響Table 5 Effect ofBaijiuingredient deficiency on ALT,AST of blood serum,SOD activity and MDA content in liver

由表5可知，各缺失成分酒樣灌胃后，小鼠急性酒精肝損傷的幾個指標與未缺失成分酒樣相比無明顯差異，這與彭彥卿等[6]報道的一次性灌胃不同醉度濃香型白酒后小鼠急性肝損傷指標均未出現明顯差異的研究結果一致。此外，彭彥卿等[6]的研究也顯示，低醉度濃香型白酒對小鼠亞急性酒精性肝損傷的程度低于高醉度濃香型白酒[6]，這提示本實驗雖然未發現缺失成分對小鼠急性酒精性肝損傷產生顯著影響，但還是需要結合小鼠亞急性或慢性酒精代謝實驗來綜合分析關鍵微量成分對白酒健康品質的影響，這需要在后續研究中進一步補充完善。

3 結論

模擬關鍵微量成分配制酒與新酒的醉度無顯著差異，而6年陳豉香型白酒醉度遠比酒精度相近的新酒及配制酒低，這與陳化使酒中的關鍵微量成分變化有關，使酒體結構更加趨于平衡協調，有利于乙醇代謝。白酒中酸、酯和雜醇將不同程度影響酒的醉度，尤其乙酸和乙酸乙酯可以顯著降低白酒醉度，而異丁醇和異戊醇則顯著增加酒的醉度。這些成分是通過影響飲酒后乙醇的代謝，改變血液乙醇和乙醛含量，進而導致醉度差異，其中雜醇尤其是異戊醇是通過抑制ADH和ALDH活性而引起醉度升高，但酸酯并不是通過改變這兩種酶活性來對醉度產生影響。另外，酒中關鍵微量成分變化不會對急性酒精性肝損傷產生顯著影響。本成果將為低醉度白酒生產的成分控制提供設計依據，并為白酒醉度深入研究提供參考。

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