響應(yīng)面法優(yōu)化修道院強(qiáng)烈艾爾啤酒釀造工藝的研究

金德強(qiáng)，王 超，翟乃明，張 薇，董小雷*

（齊魯工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院 山東省微生物重點(diǎn)試驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250353）

艾爾啤酒也稱上面發(fā)酵啤酒，是指經(jīng)過上面酵母發(fā)酵而成的啤酒，相較下面發(fā)酵啤酒其發(fā)酵速度快、香味更加豐富濃郁[1]。修道院強(qiáng)烈艾爾啤酒是比利時啤酒的重要流派，其主要利用皮爾森麥芽通過二次發(fā)酵法進(jìn)行釀造，啤酒口感醇厚，是一款麥芽與酒花香氣平衡性極佳的烈性啤酒，近些年受到了世界各地越來越多啤酒消費(fèi)者的青睞[2]。啤酒的二次發(fā)酵，即啤酒在主酵期糖分將消耗完全時，加入可發(fā)酵性糖繼續(xù)發(fā)酵[3]。由于經(jīng)過了二次發(fā)酵，因此啤酒酒體醇厚飽滿，口感順滑，口味和香氣更加豐富。由于強(qiáng)烈艾爾啤酒的酒精度較高，所以通常添加焦香麥芽、結(jié)晶麥芽和巧克力麥芽以豐富的麥芽味平衡酒精味[4-5]。

現(xiàn)階段國內(nèi)對于啤酒的研究以下面發(fā)酵啤酒為主，對于修道院強(qiáng)烈艾爾啤酒的研究較為匱乏[6]。李珊珊等[7]用桶內(nèi)二次發(fā)酵工藝釀造小麥啤酒，香氣豐富突出，口感細(xì)膩順滑，富含活性酵母，但相對應(yīng)也會出現(xiàn)酵母自溶及瓶內(nèi)壓力過高爆瓶等問題。

近幾年，修道院強(qiáng)烈艾爾啤酒在中國的進(jìn)口量一直呈上升趨勢，但進(jìn)口啤酒價格昂貴，且新鮮度沒有保障。本試驗(yàn)旨在探索影響強(qiáng)烈艾爾啤酒釀造的發(fā)酵溫度、加糖量和酒花干投量3個因素，將單因素試驗(yàn)與響應(yīng)面分析法相結(jié)合，優(yōu)化其釀造工藝條件，以期為今后的強(qiáng)烈艾爾啤酒生產(chǎn)提供有力的技術(shù)支撐，為強(qiáng)烈艾爾啤酒的生產(chǎn)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

皮爾森麥芽（4EBC）、焦香麥芽（25EBC）、結(jié)晶麥芽（300EBC）、巧克力麥芽（600EBC）：山東辛巴赫生物科技有限公司；90型顆粒酒花馬格努門（α-酸含量14%）：雅基瑪貿(mào)易（深圳）有限公司；90型顆粒酒花薩茲（α-酸含量4.5%）：巴特哈斯（北京）貿(mào)易有限公司；上面艾爾酵母BE-256：弗曼迪斯酵母有限公司；食品級白砂糖：濟(jì)南大城小愛食品有限公司；異辛烷、辛醇、鄰苯二胺（均為分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠；氫氧化鈉、氯化氫、鉻酸、無水乙醇、乙醚（均為分析純）：天津市福晨化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

ABF80-4C-11EBC標(biāo)準(zhǔn)磨粉碎機(jī)：瑞士Buhler公司；ZM30L立式自控發(fā)酵罐：濟(jì)南正麥機(jī)械設(shè)備有限公司；WYT-J手持糖度計：成都豪創(chuàng)光電儀器有限公司；YXQ-LS-75SII立式壓力滅菌鍋：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SWCJ-1BU無菌超凈工作臺：蘇州尚田潔凈技術(shù)有限公司；SD9012BEBC色度計：上海昕瑞儀器設(shè)備有限公司；WGZ-2PJ濁度計：上海昕瑞儀器設(shè)備有限公司；GSP-77-03磁力攪拌器：江蘇姜堰市分析儀器廠；ME204分析天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；UV2350紫外可見分光光度計：尤尼柯（上海）儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 修道院強(qiáng)烈艾爾啤酒釀造工藝流程

麥芽粉碎→糖化→麥汁過濾→麥汁煮沸→回旋沉淀→麥汁冷卻→發(fā)酵→降溫冷貯→成品酒

1.3.2 操作要點(diǎn)

（1）麥芽粉碎[8]

按照原麥汁糖度為17°P進(jìn)行配料，4種麥芽配比為：皮爾森麥芽（4EBC）88%、焦香麥芽（25EBC）7%、結(jié)晶麥芽（300EBC）4%、巧克力麥芽（600EBC）1%。采用增濕粉碎法將麥芽置于歐洲啤酒釀造協(xié)會（European brewery convention，EBC）推薦的標(biāo)準(zhǔn)磨進(jìn)行粉碎，磨盤刻度調(diào)至20目，粉碎效果粗細(xì)得當(dāng)，麥皮破而不碎，既不影響原料浸出率也不影響過濾速度。

（2）糖化

料水比控制為1.0∶3.5（kg∶L），采用單醪浸出糖化法，在升溫過程中應(yīng)保持?jǐn)嚢琛５谝浑A段：邊投料邊攪拌，控制醪液溫度為52℃，恒溫保持30min；第二階段：升溫至65℃，恒溫保持40 min；第三階段：升溫至72℃，恒溫保持20 min（此階段結(jié)束時取麥汁進(jìn)行碘檢，若碘檢合格，溫度直接升至78℃，反之延長72℃保溫時間直至碘檢合格）；第四階段：升溫至78℃，糖化結(jié)束。

（3）麥汁過濾

先將78～82℃的熱水加到過濾槽中，水沒過篩板即可，以排出里面的空氣并對篩板預(yù)熱。將糖化好的麥汁倒入過濾槽中，靜止20 min形成過濾層；之后進(jìn)行回流操作，當(dāng)麥汁開始澄清時即可進(jìn)行過濾；然后用78℃水進(jìn)行洗糟2次，整個過程過濾速度應(yīng)穩(wěn)定，保證麥汁清亮。

（4）麥汁煮沸[9]

將過濾好的麥汁轉(zhuǎn)移到煮沸鍋進(jìn)行煮沸，麥汁煮沸后立刻添加馬格努門酒花0.3 g/L；煮沸后55 min時添加薩茲酒花0.1 g/L。整個煮沸過程時間為60 min，煮沸強(qiáng)度（麥汁的蒸發(fā)量）控制在10%左右。

（5）回旋沉淀、麥汁冷卻

麥汁煮沸結(jié)束后轉(zhuǎn)移至回旋沉淀槽，靜置20 min，分離熱凝固物獲得澄清麥汁；利用已滅菌的盤管式換熱器將麥汁溫度降至18℃，然后轉(zhuǎn)移到發(fā)酵罐中。整個過程在發(fā)酵罐底部對麥汁進(jìn)行充氧，充氧量為8～10 mg/L。

（6）發(fā)酵

將無菌水煮沸并冷卻至20℃，按0.8 g/L的比例添加干酵母粉BE-256，靜置15 min后將酵母液搖晃均勻[10]。將活化好的酵母液按酵母液與麥汁體積比1∶100的比例添加到發(fā)酵罐中，充氧將酵母液與麥汁混合均勻，接種后的酵母濃度應(yīng)≥1.2×107個/mL。麥汁滿罐后進(jìn)行主發(fā)酵（20℃上面發(fā)酵2 d左右），當(dāng)麥汁糖度降至5°P時，加入白砂糖并干投薩茲酒花，然后封罐進(jìn)行二次發(fā)酵（上面發(fā)酵5～7 d），自然升壓至0.14～0.16 MPa，進(jìn)行雙乙酰還原。

（7）降溫冷貯

當(dāng)雙乙酰含量≤0.08 mg/L時，將啤酒降溫至0～1℃，壓力控制在0.12～0.14 MPa，降溫冷貯7 d以上，酒體發(fā)酵成熟，無需清酒。后貯期間應(yīng)注意觀察發(fā)酵罐內(nèi)壓力，壓力不足0.12 MPa時應(yīng)及時補(bǔ)充CO2，保證啤酒強(qiáng)烈的殺口力。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

以感官評分為評價指標(biāo)，考察發(fā)酵溫度（16℃、18℃、20℃、22℃、24℃）、加糖量（1%、2%、3%、4%、5%）及酒花干投量（0.2 g/L、0.4 g/L、0.6 g/L、0.8 g/L、1.0 g/L）對修道院強(qiáng)烈艾爾啤酒品質(zhì)的影響。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以感官評分（Y）為響應(yīng)值，選取發(fā)酵溫度（A）、加糖量（B）、酒花干投量（C）為自變量，設(shè)計3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，確定最佳發(fā)酵工藝條件[11]。試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 啤酒發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface analysis for beer fermentation technology optimization

1.3.5 品質(zhì)分析

（1）感官品評[12]

啤酒后貯7 d以后，由齊魯工業(yè)大學(xué)中德啤酒技術(shù)中心師生和兩位國家級品酒師組成10人（5男5女）評審小組對啤酒進(jìn)行品評。從外觀、泡沫、香氣、口感四方面進(jìn)行品評打分，滿分100分，取平均分。具體評分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 修道院強(qiáng)烈艾爾啤酒感官評價標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standards of Abbey Strong Ale Beer

續(xù)表

（2）理化及衛(wèi)生指標(biāo)

色度、濁度、苦味值、總酸、酒精度、雙乙酰及原麥汁濃度的測定：參照國標(biāo)GB/T 4927—2008《啤酒》中的測定方法[13]；大腸桿菌檢測采用最可能數(shù)（most probable number，MPN）計數(shù)法[14]；成品酒菌落數(shù)檢測采用平板計數(shù)法[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 發(fā)酵溫度對修道院強(qiáng)烈艾爾啤酒感官評分的影響

由圖1可知，當(dāng)發(fā)酵溫度在16～20℃時，隨著發(fā)酵溫度的升高感官評分呈上升趨勢；當(dāng)發(fā)酵溫度在20℃時，啤酒的綜合評分最高為90分，此時產(chǎn)品酒體醇厚，口感細(xì)膩，殺口力強(qiáng)，香氣平衡性較好；當(dāng)發(fā)酵溫度＞20℃之后，感官評分明顯下降。這可能是因?yàn)闇囟容^高時，酵母的代謝能力增強(qiáng)，發(fā)酵速度明顯加快，但同時生成的副產(chǎn)物如高級醇等也明顯增加，從而影響啤酒的品質(zhì)；當(dāng)溫度較低時，酵母的活性較弱導(dǎo)致發(fā)酵速度緩慢，導(dǎo)致發(fā)酵產(chǎn)生的酯香味不足[16]，會降低成品酒的綜合品質(zhì)，使得酒體口感較為寡淡。因此，選擇發(fā)酵溫度20℃為宜。

圖1 發(fā)酵溫度對修道院強(qiáng)烈艾爾啤酒品質(zhì)的影響Fig.1 Effect of fermentation temperature on the quality of Abbey Strong Ale Beer

2.1.2 加糖量對修道院強(qiáng)烈艾爾啤酒感官評分的影響

由圖2可知，隨著加糖量在1%～3%范圍內(nèi)增加，感官評分逐漸升高，這是因?yàn)榻湍冈跓o氧呼吸條件下通過消耗糖類生成酒精，在二次發(fā)酵時適量的加糖會提高啤酒的酒精度，使成品啤酒口感更醇厚[17]；當(dāng)加糖量為3%時，啤酒的感官評分最高為88分；但當(dāng)加糖量＞3%之后，會使啤酒酒精度過高，影響啤酒風(fēng)味的平衡，導(dǎo)致啤酒口感過于厚重[18]，感官評分逐漸下降。因此，選擇加糖量3%為宜。

圖2 加糖量對修道院強(qiáng)烈艾爾啤酒品質(zhì)的影響Fig.2 Effect of sugar addition on the quality of Abbey Strong Ale Beer

2.1.3 酒花干投量對修道院強(qiáng)烈艾爾啤酒感官評分的影響

由圖3可知，隨著酒花添加量在0.2～0.4g/L范圍內(nèi)增加，啤酒感官評分逐漸增加，這是因?yàn)楦赏毒苹苜x予啤酒一定的酒花香氣，使得啤酒風(fēng)味更富有層次感，口感更加宜人[19]；當(dāng)酒花干投量在0.4 g/L時，成品啤酒的感官評分最高，這時的啤酒香氣適宜，酒花香氣與麥芽香氣較為協(xié)調(diào)；當(dāng)酒花干投量＞0.4 g/L之后，感官評分呈現(xiàn)下降趨勢，這是因?yàn)榫苹ǜ赏读窟^高導(dǎo)致濃郁的酒花香氣掩蓋麥芽香氣，同時也會增加啤酒的苦度從而影響整體品評[20]。因此，選擇酒花干投量0.4 g/L為宜。

圖3 酒花干投量對修道院強(qiáng)烈艾爾啤酒品質(zhì)的影響Fig.3 Effect of dry hopping addition on the quality of Abbey Strong Ale Beer

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

基于Box-Behnken設(shè)計，在單因素的基礎(chǔ)上，利用Design Expert軟件分析，選取發(fā)酵溫度（A）、加糖量（B）、酒花干投量（C）3個因素，以感官評分（Y）為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面試驗(yàn)對釀造工藝進(jìn)行優(yōu)化[21]。試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果見表3，響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果方差分析見表4。

將所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用Design Expert軟件對各因素進(jìn)行多元回歸擬合，得到二次多項(xiàng)回歸方程：Y=92.00-0.87A+0.75B+0.63C+1.50AB+0.75AC-1.00BC-2.13A2-4.88B2-2.62C2。

表3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果Table 3 Design and results of Box-Behnken experiments

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis of response surface methodology experiments results

由表4可知，該回歸模型的P值＜0.0001，說明回歸模型的影響達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）；失擬項(xiàng)P=0.8580＞0.05，表明失擬項(xiàng)不顯著。模型的總決定系數(shù)R2=0.975 8，表明該模型能解析97.58%的響應(yīng)變化，僅存在2.42%的總變異，說明該模型擬合程度很好，試驗(yàn)誤差比較小。校正決定系數(shù)R2Adj=0.944 7，說明該模型響應(yīng)值的變化有94.47%來源于所選變量。響應(yīng)值Y的變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）與試驗(yàn)精確度和重復(fù)性成反比，其變異系數(shù)CV=0.94%＜5%，說明試驗(yàn)的精確度和重復(fù)性較高[22]。3個因素對響應(yīng)值的影響大小順序?yàn)锳＞B＞C，一次項(xiàng)A、B，交互項(xiàng)BC影響顯著（P＜0.05）；交互項(xiàng)AB，二次項(xiàng)A2、B2、C2影響極顯著（P＜0.01），其他因素影響不顯著（P＞0.05）。

通過Design-Expert軟件繪制發(fā)酵溫度和加糖量、加糖量和酒花干投量、發(fā)酵溫度和酒花干投量交互作用的響應(yīng)面及等高線，結(jié)果見圖4。響應(yīng)面曲面圖可反映各因素間的交互作用對響應(yīng)值影響的顯著程度，曲面圖越陡表示交互作用越強(qiáng)，曲面越平表示交互作用越弱[23]。

由圖4A可知，感官評分隨著發(fā)酵溫度和加糖量的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，曲面陡峭，等高線呈現(xiàn)橢圓形，說明發(fā)酵溫度和加糖量間的交互作用極顯著（P＜0.01）；由圖4B可知，感官評分隨著加糖量和酒花干投量的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，曲面較為陡峭，等高線呈現(xiàn)橢圓形，說明加糖量和酒花干投量間的交互作用較顯著（P＜0.05）；由圖4C可知，感官評分隨著發(fā)酵溫度和酒花干投量的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，但曲面較平緩，等高線呈現(xiàn)圓形，說明發(fā)酵溫度和酒花干投量間的交互作用不顯著（P＞0.01）。

通過Design Expert分析得到修道院強(qiáng)烈艾爾啤酒的最佳釀造工藝條件為發(fā)酵溫度19.64℃，加糖量3.04%，酒花干投量0.42 g/L。在此優(yōu)化條件下發(fā)酵，啤酒感官評分達(dá)到92.12分。考慮到實(shí)際操作的可行性，釀造工藝參數(shù)調(diào)整為發(fā)酵溫度20℃，加糖量3.04%，酒花干投量0.42 g/L，得到的產(chǎn)品感官評分均值為92.8分，與預(yù)測值相對誤差為0.74%，表明用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的修道院強(qiáng)烈艾爾啤酒釀造工藝是準(zhǔn)確可靠的。

2.3 啤酒品質(zhì)分析

對最優(yōu)工藝條件下生產(chǎn)的啤酒進(jìn)行品質(zhì)檢測，結(jié)果見表5。由表5可知，啤酒的理化指標(biāo)和衛(wèi)生指標(biāo)均符合國家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。經(jīng)釀制的修道院強(qiáng)烈艾爾啤酒呈現(xiàn)琥珀色，外觀透亮；泡沫豐富細(xì)膩，掛杯持久；香氣豐富，麥芽香氣、酯香、酒花香氣平衡宜人；口感細(xì)膩，酒體醇厚，殺口力強(qiáng)。

表5 修道院強(qiáng)烈艾爾啤酒理化、衛(wèi)生指標(biāo)檢測結(jié)果Table 5 Detection results of physicochemical and hygienic indexes of Abbey Strong Ale Beer

3 結(jié)論

本研究以皮爾森麥芽、特種麥芽和酒花為原料，考察發(fā)酵溫度、加糖量及酒花干投量對啤酒感官評分的影響。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化啤酒釀造工藝條件，得出最優(yōu)工藝參數(shù)為發(fā)酵溫度20℃、加糖量3.04%、酒花干投量0.42 g/L，此優(yōu)化條件下的產(chǎn)品感官評分為92.8分。成品啤酒呈琥珀色，泡沫稠密持久，香氣宜人，酒體醇厚，殺口力強(qiáng)，是一款理想的烈性啤酒。

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