1株產類胡蘿卜素鹽盒菌的分離鑒定及培養條件優化

高文庚，于慧瑛，李 新*

（運城學院 生命科學系，山西 運城 044000）

類胡蘿卜素是廣泛分布于動植物體內的天然色素，具有抗氧化、抗癌、增強免疫力、控制前列腺疾病和退行性黃斑衰退癥等功能，被廣泛應用于藥品、保健食品、營養強化劑等領域[1-4]。多數鹽盒菌呈不同程度的紅色，研究發現，鹽盒菌菌體內富含C45或C50高碳類胡蘿卜素，且結構中具有更多共軛雙鍵，在抗氧化活性研究方面更具科學研究價值和開發利用價值[5]。此外，該類微生物所產色素主要包括菌紅素及其衍生物、類胡蘿卜素、番茄紅素等[6-7]。

鹽盒菌屬是一類只能在高鹽環境中生存的極端環境微生物，其最適生長鹽濃度為2.5～5.2 mol/L，多生存于鹽湖、鹽田、腌制食品等鹽域環境中，具有獨特的種群分布與群落結構[8]。由于生存環境特殊，嗜鹽古菌形成了獨特的代謝機制，可產生胞外淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶、脂肪酶等多種嗜鹽酶類[9-10]，其中一些酶具有良好的穩定性，可以耐受較為苛刻的外界條件[11]。另外，一些嗜鹽菌對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及辣椒疫霉菌等具有拮抗作用[12-13]。由于鹽盒菌代謝方式及產物的特殊性，近年來備受關注，成為研究的熱點[14]。目前，對于鹽盒菌研究，主要集中在菌種分離篩選、色素組分分析及菌紅素生物學特性研究方面[5-7]，而對于產類胡蘿卜素鹽盒菌的報道相對較少，研究鹽盒菌生長及發酵特性對于天然類胡蘿卜素工業化生產顯得尤為重要。

本研究從運城鹽湖中分離獲得一株發酵液呈橘紅色的鹽盒菌菌株G14，擬采用16S rRNA基因序列分析，結合形態學觀察與生理生化特性分析等，對其進行分類鑒定，并對其進行培養條件優化，以期通過最佳條件進行菌株擴大培養，為后續利用該菌進行類胡蘿卜素發酵生產等研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株G14：分離自運城鹽湖的黑泥樣本，分離純化后4℃保存。

酸水解酪蛋白、酵母浸粉、蛋白胨等常規生化試劑：北京奧博星生物技術有限責任公司；DNA提取純化試劑盒：北京索萊寶公司；DNAMarker、EXTaqDNA聚合酶（5U/μL）、引物合成（正向引物：5'-ATTCCGGTTGATCCTGC-3'，反向引物：5'-AGGAGGTGATCCAGCCGCAG-3）'、pMD18-T載體：大連TaKaRa公司。

高鹽培養基：酸水解酪蛋白6 g/L，檸檬酸鈉3 g/L，酵母浸粉10g/L，蛋白胨5g/L，無水MgSO49.76g/L，KCl2g/L，NaCl 210～290 g/L，蒸餾水 1 000 mL，pH 7.5～8.0，121 ℃滅菌20 min后備用。固態培養基添加瓊脂2 g/100 mL。

1.2 儀器與設備

Tanon-1600凝膠成像系統：上海天能科技有限公司；T100聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增儀：美國Bio-Rad公司；TGL-16M高速臺式冷凍離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；LDZX-50K立式壓力蒸氣滅菌器：上海申安醫療器械廠；HZP-150型全溫振蕩培養箱：上海精宏實驗設備有限公司；DYY-6C電泳儀：北京市六一儀器廠；UV-6000PC紫外可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；SHP-250生化培養箱：上海飛龍儀表電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株G14的形態學觀察及生理生化特性

將分離純化的G14菌株劃線接種于固體培養基，37℃培養7 d，觀察單菌落形態特征。革蘭氏染色觀察個體形態，并參照文獻[15]對其生理生化特征進行研究。

1.3.2 菌株G14的16S rRNA基因序列分析

DNA提取及擴增體系參照文獻[16]的方法。采用通用基因組DNA提取試劑盒，提取菌株G14基因組，以總DNA為模板，采用極端嗜鹽古菌特異性引物進行16SrRNA基因的PCR擴增。正向引物：5'-ATTCCGGTTGATCCTGC-3'，反向引物：5'-AGGAGGTGATCCAGCCGCAG-3'。PCR反應體系（20μL）：無菌水13.2μL，10×PCRExTaqbuffer2.0μL，脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）Mixtures 1.6 μL，ExTaq 聚合酶 0.2 μL。PCR反應條件為：95℃預變性 1 min；95℃變性 30 s，52℃退火 1 min，72℃延伸1.5 min，30個循環；72℃再延伸10 min。PCR產物經電泳檢測后回收純化，送北京三博遠志公司測序。測序結果在GenBank數據庫中進行BLAST比對，選擇同源性較高的相關序列，利用Clustal W1.8、MEGA 5.0軟件進行多重序列比對及分析，構建菌株G14的系統進化樹，確定其分類學地位。

1.3.3 菌株G14的培養條件單因素試驗

分別測定光照處理、高鹽培養基中NaCl質量濃度、初始pH及培養溫度對菌株G14生長的影響。

在裝有150 mL液體培養基的錐形瓶中，分別接入經37℃、160 r/min振蕩培養7 d的種子液2%（V/V），一定溫度條件下160 r/min振蕩培養7 d，定時取樣測定培養液OD600nm值，比較不同培養條件對菌株G14生長的影響。單因素試驗設定分別為遮光黑暗培養、光照培養（光照強度1833lx），NaCl質量濃度分別為0.21 g/mL、0.23 g/mL、0.25 g/mL、0.27 g/mL、0.29 g/mL，初始pH分別為6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，培養溫度分別為30℃、35℃、40℃、45℃。

1.3.4 菌株G14培養條件優化正交試驗

根據單因素試驗結果，選取培養溫度（A）、初始pH值（B）、培養基NaCl質量濃度（C），采用3因素3水平L9（33）正交試驗對G14菌株培養條件進行優化，因素與水平見表1。

表1 培養條件優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for culture conditions optimization

1.3.5 菌株生長量及類胡蘿卜素含量測定

生長量測定：培養過程中1d取樣3次，每次5mL，利用分光光度計在波長600 nm條件下測定菌液的OD600nm值[17]，共培養7 d。

類胡蘿卜素含量測定：參照文獻[5]方法將培養7 d菌液100 mL離心收集菌體后，10%滅菌NaCl溶液懸洗3遍。加5 mL丙酮充分振蕩提取后離心，取上清液在波長475 nm處測定OD475nm值，類胡蘿卜素含量計算公式如下：

式中：X為類胡蘿卜素含量，μg/mL；A為最大吸收波長處的吸光度值；D為浸提液稀釋倍數；V1為丙酮添加量，mL；V2為發酵液體積，mL；E為類胡蘿卜素的消光系數。

1.3.6 數據處理

每個實驗均重復3次，運用數據處理系統（data processing system，DPS）統計軟件對試驗數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 菌株G14鑒定

2.1.1 菌株G14形態學及生理生化特征鑒定結果

菌株G14在高鹽培養基上生長良好，菌落呈橘紅色、極具光澤，中央突起、邊緣平整，革蘭氏染色呈陽性，菌體細胞呈球狀。菌株G14生理生化特征見表2。

由表2可知，菌株G14能產生淀粉水解酶、纖維素酶、明膠水解酶、脲酶、過氧化氫酶及苯丙氨酸脫氫酶等；不能產生氧化酶、蛋白酶及吲哚等；能夠還原硝酸鹽，產生H2S，甲基紅和V-P實驗的結果為陰性；菌株G14能夠利用葡萄糖、蔗糖、D-半乳糖、D-木糖作為碳源，在鹽質量濃度0.1～0.3 g/mL、pH4～10范圍內均能生長。

2.1.2 16S rRNA基因PCR擴增產物及系統進化樹構建

16S rRNA基因序列PCR擴增后的產物經1%瓊脂糖凝膠檢測，凝膠成像結果見圖1。

由圖1可知，擴增得到基因片段凝膠電泳條帶單一，均有明顯亮帶，與Marker條帶比較發現，目的基因片段大小約為1 500 bp左右。測序結果表明，菌株G14的16S rRNA基因序列為1 420 bp，兩者相符。

由于16S rRNA基因序列分析及系統進化關系推斷在嗜鹽古菌種級以上分類單元的界定中具有較強的分辨力[18]，將基因序列提交GenBank數據庫中，序列號為JN112004。采用鄰接法（neighbor-joining，NJ）構建系統進化樹，結果見圖2。

圖2 基于16S rRNA基因序列采用鄰接法構建的菌株G14的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain G14 constructed by neighborjoining method based on 16S rRNA gene sequences

由圖2可知，與菌株G14同源性最高的是Haloarcula argentinensisJCM 9737，相似度最高達97.3%，具有較近的親緣關系，結合形態學觀察結果和生理生化特征，鑒定其為鹽盒菌屬（Haloarculasp.）。

2.2 菌株G14培養條件的單因素試驗

2.2.1 光照對菌株G14生長的影響

圖3 光照對菌株G14生長的影響Fig.3 Effect of light on the growth of strain G14

由圖3可知，光照對于菌株生長的延滯期、對數期均有較大的影響。在相同的培養條件下，光照可明顯縮短菌株G14的延滯期，由40 h縮短至20 h；培養40 h后兩種處理均進入對數期，但處于光照環境中菌株G14的菌體生長量顯著高于黑暗環境（P＜0.05）；培養114 h后進入穩定期，短于黑暗培養的138 h，并且在70 h后菌液有淡紅色出現，而后者培養液始終呈黃色。進入穩定期后兩種處理菌液的OD600nm值沒有顯著性差異（P＞0.05），說明光照對菌體生長繁殖速度及類胡蘿卜素產生非常重要，但卻對最終的總菌體量沒有顯著影響（P＞0.05）。

2.2.2 NaCl質量濃度對菌株G14生長的影響

圖4 不同的NaCl質量濃度對菌株G14生長的影響Fig.4 Effects of different NaCl mass concentration on the growth of strain G14

由圖4可知，培養基NaCl質量濃度對菌株G14的生長影響較大。NaCl質量濃度為0.21～0.25g/mL時，隨著培養時間的變化，培養液OD600nm值的變化趨勢基本一致，其中NaCl質量濃度為0.23g/mL時，對數期菌體生長速率最大，進入穩定期后菌液的OD600nm值相比較于其他質量濃度大，且差異顯著（P＜0.05）。而NaCl質量濃度為0.21 g/mL和0.25 g/mL的條件下，培養液OD600nm值無顯著差異（P＞0.05）。NaCl質量濃度為0.23 g/mL時菌株G14生長效果最好。當培養基NaCl質量濃度繼續升高，菌體生長受到抑制，菌體對數期生長速率越低，進入穩定期越遲，并且穩定期培養液中菌體濃度越低。因此，NaCl質量濃度0.23 g/mL時為宜。

2.2.3 初始pH值對菌株G14生長的影響

圖5 不同的初始pH值對菌株G14生長的影響Fig.5 Effects of the different initial pH values on the growth of strain G14

由圖5可知，初始pH值為7.0的培養液中對數期菌體生長速率最大，穩定期菌液OD600nm值極顯著高于其他水平（P＜0.01）。當pH過高或過低，菌體生長都會受到抑制。初始pH值為6.0時延滯期明顯延長，穩定期開始時間和穩定期菌體濃度與pH 8.0時幾乎一致，無顯著差異（P＞0.05）。pH 8.0與pH 7.0條件下菌體生長量變化趨勢基本一致，但各階段生物量均低于后者。隨著pH升高，菌株G14生長各階段均受到影響，至初始pH為10.0時生長幾乎完全限制。因此初始值pH7.0時為宜。

2.2.4 培養溫度對菌株G14生長的影響

圖6 不同培養溫度對菌株G14生長的影響Fig.6 Effects of the different culture temperature on the growth of strain G14

由圖6可知，培養溫度對于菌株生長的對數期影響較大。在30～45℃溫度范圍內，隨著培養溫度的上升，菌體培養的延滯期縮短，對數期菌體生長速率增大，進入穩定期的時間提前，但進入穩定期后40℃培養OD600nm值較高，與30℃有顯著差異（P＜0.05），其他3個溫度水平基本一致，未出現顯著差異（P＞0.05）。因此，培養溫度40℃為宜。

2.3 菌株G14培養條件的正交試驗

在單因素試驗的基礎上，綜合考慮各因素對菌體生長的影響，采取光照培養，以OD600nm值為評價指標，選取培養溫度（A）、初始pH值（B）以及NaCl質量濃度（C）為評價因素，應用3因素3水平L9（33）進行正交試驗，培養140 h測定OD600nm值，從而進一步確定最佳培養條件。正交試驗結果與分析見表3，方差分析見表4。

表3 培養條件優化正交試驗結果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for culture conditions optimization

由表3可知，對菌株生長影響因素由大到小的順序依次為B＞A＞C，即初始pH對菌體生長影響最大，培養溫度次之，NaCl質量濃度影響最小。由正交試驗結果與極差分析可以得出菌株G14生長的最優培養條件組合為A3B2C2，即培養溫度43℃、初始pH 7.0、NaCl質量濃度0.23 g/mL。在此優化培養條件下，經過驗證試驗檢測培養液OD600nm值達到2.24。測定此時培養液類胡蘿卜素產生量為0.65 mg/L。

表4 正交試驗結果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表4可知，初始pH值對菌體生長有極顯著影響（P＜0.01），而培養溫度及NaCl質量濃度在試驗設定水平范圍內對菌體生長沒有顯著影響（P＞0.05）。

3 結論

試驗對分離自運城鹽湖黑泥樣品中的一株產生類胡蘿卜素菌株G14進行形態觀察、生理生化特性及16S rRNA基因序列分析，發現該菌屬于鹽盒菌屬（Haloarculasp.），為極端嗜鹽古菌。并采用單因素分析及正交試驗對菌株培養條件進行優化，得出菌株G14的最佳培養條件為培養溫度43℃，NaCl質量濃度為0.23 g/mL，初始pH值為7.0。在該優化條件下，培養液OD600nm值達到2.24，類胡蘿卜素產量為0.65 mg/L。該研究結果對菌株G14的菌體大規模培養及高鹽發酵代謝產物開發利用提供了理論依據。

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