丁酸梭菌優(yōu)良菌株LXYB-2抑菌活性及抗逆性研究

謝麗靜，王 麗，王偉華，王海寬，張仁文*

（1.湖北綠雪生物科技有限公司，湖北 咸寧 437000；2.塔里木大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300；3.天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457）

丁酸梭菌（Clostridium butyricum）屬于厭氧革蘭氏陽性菌，電子顯微鏡下觀察其菌體形態(tài)呈直或略有彎曲的桿狀，單個(gè)或成對(duì)，部分呈絲狀，短鏈，白色略帶灰感，細(xì)菌直徑為（0.6～1.4）×（2.7～7.3）μm，菌體中間略飽滿，兩端呈鈍圓形，周身有鞭毛，具運(yùn)動(dòng)性[1]。研究表明丁酸梭菌作為益生菌制劑中的一種，又稱活菌制劑[2]，不僅具有抑制腸道有害菌群的生長作用，同時(shí)能夠促進(jìn)有益菌群的增殖[3]；其作用機(jī)理可歸結(jié)為丁酸梭菌益生菌產(chǎn)生的非特異性短鏈脂肪酸和過氧化物以及其代謝產(chǎn)生的特異性的細(xì)菌素，能夠抑制或殺死潛在的致病菌[4]。

丁酸梭菌是我國在2009年由農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)允許在飼料中添加的活菌制劑之一。微生態(tài)制劑是否能作為飼料添加劑應(yīng)用于養(yǎng)殖業(yè)，不僅需要考察菌株的發(fā)酵水平、產(chǎn)益生物質(zhì)的能力，同時(shí)還需要考察菌株抗逆性，如在動(dòng)物胃腸道環(huán)境中生存能力，耐受飼料加工過程中的高溫環(huán)境等。丁酸梭菌作為一種梭狀芽孢桿菌，具有一定耐高溫、耐動(dòng)物胃腸道環(huán)境的能力，但是這些特性在不同菌株之間存在較大的差異。賈麗楠等[5]對(duì)丁酸梭菌85℃高溫處理2.5 min、5.0min、7.5min后，其存活率分別為70.43%、52.69%、46.35%。劉磊等[6]將丁酸梭菌CBM01在人工胃液和人工腸液中作用3 h后，丁酸梭菌CBM01存活率分別為90.33%和92.09%，同時(shí)發(fā)現(xiàn)菌株CBM01可耐受的最高膽鹽濃度為0.40%。王騰浩等[7]對(duì)一株丁酸梭菌ZJU-F1抗逆性和體外益生效果進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)該菌株對(duì)人工胃液、腸液及膽堿都具有很好的耐受性，pH值為2的人工胃液處理對(duì)其幾乎沒有影響，然后再用人工腸液處理2 h，活菌數(shù)沒有明顯變化；該菌株能夠在0.35%的膽鹽條件下生長。體外抑菌活性比較也是考察菌株產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)能力的一種方法，一般認(rèn)為在同樣的環(huán)境條件下，對(duì)動(dòng)物體內(nèi)常見病原菌抑菌活性較強(qiáng)的菌株其產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)能力更強(qiáng)，因此需要比較不同菌株對(duì)腸道常見致病菌抑制效果，來進(jìn)一步評(píng)價(jià)優(yōu)良菌株的應(yīng)用潛力。曹廣添等[8]研究發(fā)現(xiàn)，將丁酸梭菌分別與大腸桿菌、沙門菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、乳酸桿菌和雙歧桿菌按不同的比例混合后進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間36～48 h，結(jié)果表明，丁酸梭菌對(duì)大腸桿菌、沙門菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌的增殖有明顯抑制作用。

目前國內(nèi)外對(duì)丁酸梭菌抗逆性的研究主要集中對(duì)自然選育得到的菌株抗逆性研究，而對(duì)突變菌株的抗逆性研究鮮有報(bào)道。本研究以一株通過常壓室溫等離子體（atmospheric and room temperature plasm，ARTP）誘變篩選到的優(yōu)良菌株LXYB-2為研究對(duì)象，比較了優(yōu)良菌株LXYB-2與起始菌株LXKJ-1的抑菌能力及高溫、人工胃液、人工腸液、膽堿的耐受性，以確定優(yōu)良菌株LXYB-2的應(yīng)用潛力，為進(jìn)一步的篩選和挖掘益生菌的應(yīng)用潛力提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

1.1.1 菌株來源

丁酸梭菌（Clostridium butyricum）LXKJ-1為出發(fā)菌株（菌株保藏號(hào)為CCTCCM201613）：由湖北綠雪生物有限公司研發(fā)中心提供；丁酸梭菌優(yōu)良菌株LXYB-2是本實(shí)驗(yàn)室以LXKJ-1作為出發(fā)菌株，通過ARTP誘變處理，經(jīng)初篩、復(fù)篩、遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)，得到一株耐丁酸、遺傳穩(wěn)定性好、發(fā)酵水平高的突變優(yōu)良菌株。

靶標(biāo)菌：大腸埃希氏菌（Escherichiacol）iCMCC（B）44103，金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）MASA，表皮葡萄球菌（S.epidermidis）CMCC26069，宋內(nèi)志賀氏菌（Shigella sonnei）CMCC（B）51592，單核細(xì)胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）ATCC19114，傷寒沙門氏菌（Salmonella typhi）CMCC（B）50071，鼠傷寒沙門氏菌（S.typhimurium）ATCC14028，腸炎沙門氏菌（S.enteritidis）CMCC（B）50335，福氏志賀氏菌（S.flexneri）CMCC（B）51572：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

強(qiáng)化梭菌培養(yǎng)基（reinforced clostridial medium，RCM）、LB瓊脂培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆瓊脂（tryptic soy agar，TSA）培養(yǎng)基：海博生物技術(shù)有限公司。

斜面培養(yǎng)基：酵母浸膏0.5%，胰蛋白胨0.5%、葡萄糖0.1%、磷酸氫二鉀0.1%，瓊脂粉1.5%，pH值7.0。

種子培養(yǎng)基：RCM液體培養(yǎng)基。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，牛肉粉10.0 g，酵母粉3.0 g，葡萄糖5.0 g，可溶性淀粉1.0 g，L-半胱氨酸鹽粉3.0 g，磷酸氫二鉀 0.05 g，硫酸鎂0.08 g，硫酸錳0.002 g，純化水1 000 mL，pH 7.0。

活菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基：胰蛋白胨1.0 g，大豆蛋白胨0.5 g，酵母浸粉0.3 g，蛋白胨1 g，氯化鈉0.3 g，硫代乙醇酸鈉0.03 g，L-半胱氨酸鹽酸鹽0.03 g，磷酸氫二鉀0.25 g，葡萄糖1.0 g，瓊脂粉2.0 g，pH 6.5。

以上培養(yǎng)基制備完成后均需高壓滅菌備用，滅菌溫度121℃，滅菌時(shí)間20min。

1.1.3 化學(xué)試劑

胰蛋白胨、瓊脂粉、酵母浸膏（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；玉米粉：河南振興生物技術(shù)有限公司；葡萄糖、硫酸銨、尿素、磷酸氫二鉀（均為分析純）：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；豬膽鹽（純度＞98%）：成都市科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

GL-16A高速冷凍離心機(jī)：湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司；XSP-24N生物顯微鏡：南京江南永新光學(xué)有限公司；MD-0.6型脈動(dòng)真空滅菌柜：張家港市歐思瑞科技有限公司；M2204電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；FS-CJ-2F垂直送風(fēng)超凈工作臺(tái)：蘇州馮氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)備有限公司；BMJ-250C培養(yǎng)箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 優(yōu)良菌株LXYB-2與初始菌株LXKJ-1的抑菌活性比較

（1）丁酸梭菌發(fā)酵液的制備

將甘油管保藏的菌株LXYB-2與出發(fā)菌株LXKJ-1分別取0.1mL接種到10mL液體RCM培養(yǎng)基中，厭氧培養(yǎng)18h，備用。

將活化的突變優(yōu)良菌株LXYB-2與出發(fā)菌株LXKJ-1分別接種于種子液培養(yǎng)基，厭氧培養(yǎng)24 h，再按5%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，37℃厭氧培養(yǎng)48 h，14 000 r/min離心5 min，收集上清液，經(jīng)0.2 μm濾膜過濾除菌后備用。

（2）靶標(biāo)菌的制備

將大腸埃希氏菌CMCC（B）44103、腸炎沙門氏菌CMCC（B）50335、鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028、傷寒沙門氏菌CMCC（B）50071劃線接種于LB固體培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)24h，依次用無菌生理鹽水洗脫菌體，制備菌懸液，并將菌懸液的菌濃度稀釋為106CFU/mL，備用。

將金黃色葡萄球菌MASA、宋內(nèi)志賀氏菌CMCC（B）51592，單核細(xì)胞增生李斯特菌ATCC19114、福氏志賀氏菌CMCC（B）51572和表皮葡萄球菌CMCC26069依次接種于TSA固體培養(yǎng)基上，于37℃條件下培養(yǎng)24 h，依次用生理鹽水洗脫，制備菌濃度為106CFU/mL左右的菌懸液后，備用。

（3）靶標(biāo)菌平板制備

采用雙層平板法制備靶標(biāo)菌平板。取15 mL培養(yǎng)基加入到培養(yǎng)皿，凝固后作為下層；取5 mL含2%不同靶標(biāo)菌菌懸液的培養(yǎng)基加入凝固后的下層培養(yǎng)基上作為上層，待用。

（4）抑菌能力測定

采用牛津杯法測定抑菌活性。將牛津杯垂直放在制備好的不同靶標(biāo)菌平板上，使其與培養(yǎng)基表面無空隙后，在牛津杯中加入240 μL丁酸梭菌發(fā)酵上清液，于37℃條件下培養(yǎng)16～18 h，觀察并測量抑菌圈直徑。每組測定兩個(gè)重復(fù)。抑菌圈越大，表明抑菌活性越強(qiáng)[9-11]。

1.3.2 優(yōu)良菌株LXYB-2與初始菌株LXKJ-1的抗逆性比較

（1）丁酸梭菌樣品菌液的制備

將活化菌株LXKJ-1與LXYB-2分別接種至種子培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)24 h后，按5%接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，37℃厭氧培養(yǎng)48 h，發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，3 000 r/min離心10 min，收集菌體，磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌兩次后重懸，使菌體濃度為5.0×108CFU/mL，備用。

（2）耐熱性試驗(yàn)

取上述菌液樣品1mL到含9mL甘油溶液（80%甘油）的試管中，漩渦振蕩充分混勻后，分別置于60℃、70℃、80℃、90℃、100℃的水浴中處理5 min，置于0℃冰水混合物中冷卻，3000r/min離心10min，收集菌體，PBS洗滌兩次后重懸，采用梯度稀釋平板法測定其活菌數(shù)[6-8]。每個(gè)樣品重復(fù)3次，同時(shí)計(jì)算存活率，其計(jì)算公式如下：

（3）人工胃液耐受性試驗(yàn)

人工胃液參照2015版《中國藥典》進(jìn)行配制。

取上述樣品菌液1 mL到9 mL人工胃液中，人工胃液最終pH值調(diào)為1.5左右，振蕩混勻，37℃水浴孵育，每隔0.5 h取樣，將經(jīng)過人工胃液處理后的菌懸液，3 000 r/min離心10 min，PBS洗滌兩次后重懸，梯度稀釋法活菌計(jì)數(shù)，每個(gè)樣品重復(fù)3次[9-11]，同時(shí)計(jì)算存活率。

（4）人工腸液耐受性試驗(yàn)

人工腸液參照2015版《中國藥典》進(jìn)行配制。

取上述樣品菌液1 mL到9 mL人工腸液中振蕩混勻，37℃水浴孵育2 h，毎隔0.5 h取樣，3 000 r/min離心10 min，PBS緩沖液洗滌兩次后重懸，采用梯度稀釋法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，每個(gè)樣品重復(fù)3次[12]，計(jì)算存活率。

（5）膽鹽耐受性試驗(yàn)

在種子培養(yǎng)基中加入不同量的豬膽鹽，使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%，混勻，121℃、15 min滅菌后備用。按107CFU/mL接種量分別接種，厭氧培養(yǎng)24 h，觀察菌體生長情況，并用紫外分光光度計(jì)測定菌液的OD600nm值，每個(gè)樣品重復(fù)3次[11，13]。

1.3.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

通過Excel 2010對(duì)本研究得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并計(jì)算活菌數(shù)的存活率，后利用SPASS19.0軟件進(jìn)行方差分析，當(dāng)存在顯著差異時(shí)，用Duncan氏多重比較法檢測組間差異性，0.01＜P＜0.05，表示差異顯著；P＜0.01，表示差異極顯著。結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。并利用Origin Pro 8.0軟件對(duì)本研究中部分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 優(yōu)良菌株LXYB-2與初始菌株LXKJ-1發(fā)酵液抑菌活性比較

益生菌作為活菌制劑，對(duì)常見致病菌都具有一定的抑菌活性，丁酸梭菌作為活菌制劑的一種，也不例外。優(yōu)良菌株LXYB-2與出發(fā)菌株LXKJ-1發(fā)酵液抑菌活性結(jié)果見圖1，抑菌圈測量結(jié)果見表1。

圖1 菌株LXYB-2與菌株LXKJ-1發(fā)酵液抑菌活性比較Fig.1 Comparison of antibacterial activities of fermentation broth of strains LXYB-2 and LXKJ-1

由圖1和表1可知，兩株丁酸梭菌菌株對(duì)常見的9種致病菌都具有抑菌活性，通過對(duì)兩株菌抑菌直徑的比較，發(fā)現(xiàn)兩株菌對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌和金黃色葡萄球菌抑菌活性對(duì)比差異不顯著（P＞0.05），剩余7種均差異性顯著（P＜0.05），且優(yōu)良菌株LXYB-2對(duì)常見的9種致病菌抑制作用比初始菌株LXKJ-1更強(qiáng)，因此優(yōu)良菌株LXYB-2具有更好的應(yīng)用前景。

表1 菌株LXYB-2與LXKJ-1發(fā)酵液抑菌活性Table 1 Antibacterial activities of fermentation broth of strains LXYB-2 and LXKJ-1

大腸桿菌和沙門氏菌是引起動(dòng)物腹瀉的主要腸道病原菌，與出發(fā)菌株LXYB-1相比，優(yōu)良菌株LXYB-2對(duì)上述常見致病菌表現(xiàn)出更強(qiáng)的抑制活性，大腸埃希氏菌CMCC（B）44103抑菌直徑提高了24.7%；傷寒沙門氏菌CMCC（B）50071抑菌直徑提高了23.99%；鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028抑菌直徑提高了32.6%；腸炎沙門氏菌CMCC（B）50335抑菌直徑提高了37.6%；說明丁酸梭菌LXYB-2比出發(fā)菌株LXYB-1更具有替代抗腹瀉抗生素的潛力。

林秋云等[14]發(fā)現(xiàn)，丁酸梭菌對(duì)葡萄球菌尤其是對(duì)金黃色葡萄球菌具有強(qiáng)烈的抑制作用，但在本試驗(yàn)中，兩株菌株對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性差異不顯著（P＞0.05），究其原因可能是丁酸梭菌代謝產(chǎn)物較為復(fù)雜，起到抑菌活性的物質(zhì)不單一，優(yōu)良菌株LXYB-2與出發(fā)菌株LXYB-1相比較究竟是何種具有抑菌性的代謝產(chǎn)物增加了還需要進(jìn)一步研究。

丁酸梭菌體外抑菌試驗(yàn)的抑菌機(jī)理，目前公認(rèn)的使其代謝產(chǎn)生短鏈脂肪酸類，降低生長環(huán)境的pH，抑制有害菌生長，減少有害菌在腸道內(nèi)定殖，還通過營養(yǎng)競爭，抑制了有害菌生長[16]；或代謝物質(zhì)中含有蛋白類或多肽類物質(zhì)對(duì)有害菌的抑制[8]；本研究中兩株丁酸梭菌對(duì)9種常見動(dòng)物致病菌均具有抑制作用，但經(jīng)過常壓室溫等離子體（atmospheric and roomtemperature plasma，ARTP）誘變篩選后的優(yōu)良菌株其抑菌作用更強(qiáng)，可能是由于突變菌株產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)基因的表達(dá)量提高了，導(dǎo)致突變菌株產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)能力增強(qiáng)了，究其作用機(jī)理卻依然值得進(jìn)一步探討[15-16]。

2.2 優(yōu)良菌株LXYB-2與初始菌株LXKJ-1的抗逆性比較結(jié)果

2.2.1 耐熱性比較結(jié)果

菌株的高溫耐受性，是微生態(tài)制劑是否能夠在飼料加工過程中存活下來的一個(gè)主要考察指標(biāo)，耐熱性直接關(guān)系到其應(yīng)用范圍，因此耐熱性考察以及耐熱性菌株的篩選是非常重要的。飼料加工過程溫度與時(shí)間一般為85℃，5 min內(nèi)[17]，實(shí)驗(yàn)組分別按照1.3.2中制備的出發(fā)菌株LXKJ-1和優(yōu)良菌株LXYB-2的菌懸液為對(duì)照，對(duì)出發(fā)菌株LXKJ-1和優(yōu)良菌株LXYB-2的耐熱性進(jìn)行比較，兩株菌的高溫耐受性結(jié)果分別見表2和表3。

表2 菌株LXKJ-1的高溫耐受性結(jié)果Table 2 Results of resistance of strain LXKJ-1 to high temperature

表3 菌株LXYB-2的高溫耐受性結(jié)果Table 3 Results of resistance of strain LXYB-2 to high temperature

由表2和表3可知，菌株LXKJ-1與菌株LXYB-2都具有較好的耐熱性，在80℃處理5 min后，活菌數(shù)均為4.96×108CFU/mL，活菌數(shù)差異性比較不顯著（P＞0.05）；但是隨著溫度的上升，兩株菌高溫耐受性開始下降，90℃條件下處理5 min后活菌數(shù)分別為2.45×108CFU/mL和4.12×108CFU/mL，數(shù)據(jù)分析差異性比較顯著（P＜0.05）。兩株菌分別在90℃和100℃條件下處理5min后，兩株菌株的高溫耐受性存在顯著差異性（P＜0.05），且菌株LXYB-2的存活率較初始菌株分別高了32.4%和17.4%，說明菌株LXYB-2比菌株LXKJ-1具有更好的高溫耐受性。

丁酸梭菌高溫耐受性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，兩株菌都可以耐受飼料加工過程中的高溫過程，但是隨著加熱溫度的上升，菌體的存活率呈下降狀態(tài)，在實(shí)際的飼料處理或制粒的過程中，工廠需要縮短熱處理時(shí)間，時(shí)間過長會(huì)造成菌體的大量滅活[18]。

2.2.2 人工胃液耐受性研究結(jié)果

動(dòng)物的胃液屬于酸性環(huán)境，一般pH值在2.5～3.0[19]，丁酸梭菌是否能夠進(jìn)入腸道內(nèi)定殖和發(fā)揮作用，必須經(jīng)過胃液環(huán)境的考驗(yàn)，而食物在胃中消化時(shí)間一般為1～2 h[20-21]，因此，胃液耐受性考察是作為丁酸梭菌應(yīng)用潛力考察的一個(gè)重要指標(biāo)。分別以按照1.3.2中制備的出發(fā)菌株LXKJ-1和優(yōu)良菌株LXYB-2的菌懸液為對(duì)照，比較兩株菌株人工胃液耐受性差異，菌株LXKJ-1的人工胃液耐受性結(jié)果見表4，優(yōu)良菌株LXYB-2人工胃液耐受性結(jié)果見表5。

表4 LXKJ-1人工胃液耐受性結(jié)果Table 4 Results of resistance of strain LXKJ-1 to artificial gastric fluid

表5 LXYB-2人工胃液耐受性結(jié)果Table 5 Results of resistance of strain LXYB-2 to artificial gastric fluid

由表4和表5可知，菌株LXYB-2與菌株LXKJ-1經(jīng)人工胃液處理2.0 h后，活菌數(shù)分別為4.93×108CFU/mL和4.49×108CFU/mL，活菌數(shù)差異性分析不顯著（P＞0.05），說明兩株菌株胃液耐受性都較強(qiáng)。菌株LXYB-2經(jīng)人工胃液處理2.0 h后活菌數(shù)變化不明顯為4.93×108CFU/mL，而菌株LXKJ-1活菌數(shù)降低10%左右，為4.49×108CFU/mL，說明菌株LXYB-2人工胃液耐受性優(yōu)于出發(fā)菌株LXKJ-1。

2.2.3 人工腸液耐受性研究結(jié)果

張媛媛等[23]指出小腸液的pH值為7.5左右，食物通過小腸的時(shí)間為1.5 h；實(shí)驗(yàn)按照1.3.2中制備的出發(fā)菌株LXKJ-1和優(yōu)良菌株LXYB-2的菌懸液為對(duì)照，出發(fā)菌株LXKJ-1人工腸液耐受性結(jié)果見表6；優(yōu)良菌株LXYB-2人工腸液耐受性結(jié)果見表7。

由表6和表7可知，菌株LXYB-2與菌株LXKJ-1對(duì)人工腸液都具有很好的耐受性，人工腸液處理2.0h，活菌數(shù)均為5.0×108CFU/mL，菌株LXYB-2與菌株LXKJ-1的活菌數(shù)變化無顯著差異性（P＞0.05），說明菌株LXYB-2與菌株LXKJ-1都可以在腸道內(nèi)保持較高的存活率。

表6 菌株LXKJ-1人工腸液耐受性結(jié)果Table 6 Results of resistance of strain LXKJ-1 to artificial intestinal fluid

表7 菌株LXYB-2人工腸液耐受性結(jié)果Table 7 Results of resistance of strain LXYB-2 to artificial intestinal fluid

在模擬胃、腸液耐受性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，兩株丁酸梭菌都具有非常好的耐受性，但是在實(shí)際應(yīng)用過程中，胃腸道環(huán)境、飼料中大量抗生素類物質(zhì)的添加、高銅高鋅等因素是否都丁酸梭菌的生存繁殖有影響還需要進(jìn)一步驗(yàn)證和考察。

2.2.4 膽鹽耐受性研究結(jié)果

菌株的特性決定了其腸道膽鹽的耐受性，一般情況下動(dòng)物腸道內(nèi)膽鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為0.03%～0.30%，菌株膽鹽耐受性是影響其在腸道定殖的重要因素[22]。菌株LXKJ-1與LXYB-2的膽鹽耐受性結(jié)果見圖2。

圖2 菌株LXKJ-1與LXYB-2膽鹽耐受性比較Fig.2 Comparison of bile salt resistance between strains LXKJ-1 and LXYB-2

由圖2可知，優(yōu)良菌株LXYB-2與起始菌株LXKJ-1都對(duì)膽鹽具有很好的耐受性，但是優(yōu)良菌株LXYB-2在人工膽鹽濃度0.4%條件下能夠正常生長，而出發(fā)菌株LXKJ-1在該濃度下菌株的生長已經(jīng)受到抑制，兩株菌的人工膽鹽耐受性差異性顯著（P＜0.05），說明菌株LXYB-2比菌株LXKJ-1更具有膽鹽耐受性，可以保證了其可以順利地通過小腸，并最終成功定殖于動(dòng)物腸道后端。

3 結(jié)論

通過對(duì)菌株LXYB-2與LXKJ-1的抑菌能力比較得出，兩株菌對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌和金黃色葡萄球菌抑菌活性對(duì)比差異不顯著（P＞0.05），對(duì)剩余7種靶標(biāo)菌的抑制能力均差異性顯著（P＜0.05），且優(yōu)良菌株LXYB-2對(duì)常見的9種致病菌抑制作用比初始菌株LXKJ-1更強(qiáng)。

通過對(duì)菌株LXYB-2與LXKJ-1的溫度、人工胃液、人工腸液及膽鹽耐受性的測定和比較得出：菌株LXKJ-1和菌株LXYB-2都具有較好的高溫耐受性，90℃處理5 min，菌株LXYB-2存活率較菌株LXKJ-1高32.4%，差異顯著（P＜0.05）；兩株丁酸梭菌菌株均具有很好的人工胃液、人工腸液耐受性，且差異不顯著（P＞0.05）；菌株LXYB-2與菌株LXKJ-1都對(duì)膽鹽具有較好的耐受性，且菌株LXYB-2比菌株LXKJ-1膽鹽耐受性更強(qiáng)，在膽鹽濃度為0.4%時(shí)，菌株LXYB-2依然可以正常生長，較菌株LXKJ-1膽鹽耐受濃度提高了0.1%，膽鹽耐受性差異顯著（P＜0.05）。說明優(yōu)良菌株LXYB-2更具有應(yīng)用潛力，這為進(jìn)一步的篩選和挖掘益生菌的應(yīng)用潛力提供了參考。

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