鳳窩酒曲中乳酸菌的分離及其作用下的米酒品質評價

王丹丹，倪 慧，趙慧君，張振東*

（湖北文理學院 化學工程與食品科學學院 鄂西北傳統發酵食品研究所，湖北 襄陽 441053）

孝感米酒是我國國家地理標志產品，使用孝感歷史承傳的鳳窩酒曲經糖化發酵釀制而成，清香襲人，甜潤爽口，遠近知名，深受廣大人民喜愛。鳳窩酒曲是一種甜酒曲，使用多種當地的金銀果、香草、薄荷草等植物材料結合優質糯米，以孝感當地獨特工藝制成。好曲出好酒，孝感米酒的優良感官體驗與鳳窩酒曲中的微生物密不可分。米酒曲中富含酵母菌、霉菌與乳酸菌等多種微生物[1-3]，它們相互作用，協同代謝產生了孝感米酒的卓越口感。

乳酸菌（lactic acid bacteria）是一種革蘭氏陽性菌，多數為過氧化氫酶陰性，不運動，代謝產生的主要有機酸為乳酸。乳酸菌是一類重要的微生物，廣泛分布于多種發酵食品中（如米酒、黃酒、火腿、一些發酵乳制品等[4-6]），它們通過代謝作用產生多種滋味與風味物質，對傳統發酵食品的口感與風味形成具有重要作用[7-9]。此外，乳酸菌還有具有降血壓、降膽固醇、提高機體免疫力等多種營養保健功效[10]。研究表明，甜酒曲中含有植物乳桿菌、腸球菌、戊糖片球菌、魏斯氏菌等多種乳酸菌菌群[11]，是乳酸菌的優質資源庫。由于鳳窩酒曲采用自然培養的方法富集環境中的有益乳酸菌，故品質并不穩定，并且隨著人類居住環境的變化，有些乳酸菌資源可能存在著消失的風險。雖然對鳳窩酒曲中的微生物已有不少報道，如酒曲中酵母菌[3]、根霉[2]的分離及其特性的研究，也有采用宏基因組策略對鳳窩酒曲真菌群落結構的揭示[1]，然而對鳳窩酒曲中的乳酸菌資源的收集及其在米酒中的應用研究尚少。

本研究以孝感地區傳統工藝制作的鳳窩酒曲為材料，分離并鑒定酒曲中的乳酸菌，然后使用這些乳酸菌制作米酒，揭示這些乳酸菌對米酒品質的影響，旨在為米酒復合發酵劑的開發提供理論支持與優質的乳酸菌資源，為米酒的產業化發展提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酒曲：安琪甜味型甜酒曲；糯米：購自襄陽市鑫源超市；牛肉膏、酵母膏、檸檬酸鈉、葡萄糖、吐溫80、瓊脂、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸錳、氯化鈉、蛋白胨、瓊脂糖、氫氧化鈉：上海國藥集團化學試劑有限公司；AxygenPCR清潔試劑盒：康寧生命科學吳江有限公司；rTapDNA聚合酶（5U/μL），10×PCR buffer（含有Mg2+），脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）mixture（2.5 mmol/L），pMD18-T克隆載體：寶生物工程大連有限公司；大腸桿菌（Escherichia coli）：實驗室保存；27F和1495R（10 μmol/L）：由武漢天一輝遠生物科技有限公司合成。

1.2 儀器與設備

HR40-ⅡB2型生物安全柜：青島海爾特種電器有限公司；QYC-2102C全溫培養搖床：上海新苗醫療器械制造有限公司；SA402B味覺分析系統：日本INSENT公司；LC-20ADXR液相色譜儀：日本島津公司；ABIVeriti 96孔梯度PCR儀：美國Veriti公司；Fluor Chem FC3化學發光凝膠成像系統：美國ProteinSimple公司；V1800可見分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；Abbemat 350全自動折光儀：奧地利安東帕（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

從湖北省孝感市農貿市場收集不同家庭來源的鳳窩酒曲樣品5份，裝入樣品箱迅速帶回實驗室。

1.3.2 乳酸菌的分離純化

使用無菌研缽將米酒曲研磨均勻，稱取1 g米酒曲到15 mL無菌石蕊牛乳中，37℃培養24 h。將培養液進行倍比稀釋，取10-4、10-5、10-6等3個梯度的稀釋液，使用含有CaCO3（1.5%）的MRS固體平板涂布，然后置于厭氧工作站（80%N2，5%H2，15%CO2）中37 ℃厭氧培養48 h。挑取有透明圈的菌落，以劃線法連續劃線3次進行純化，并進行革蘭氏染色實驗與過氧化氫酶接觸酶實驗。然后將完成純化的菌株使用30%的甘油，保存在-80℃冰箱待用。

1.3.3 乳酸菌的鑒定

將純化過的乳酸菌接種于在液體MRS培養基過夜培養，然后收集菌體，按照MVEOBIANG A等方法[12]提取乳酸菌總DNA。以所提取的乳酸菌總DNA為模板，使用細菌通用引物27F與1495R[13]進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增。PCR反應體系：10×PCR buffer 5 μL，dNTP mixture 4 μL，rTaqDNA聚合酶0.4 μL，乳酸菌基因組DNA 0.5 μL，通用引物27F和1495R各1 μL，加雙蒸水補充至50 μL。PCR擴增程序[13]：94℃預變性4 min；94℃預變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸90 s，30個循環；72℃延伸10 min。然后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物質量后，使用PCR清潔試劑盒清潔對PCR產物進行純化，然后將PCR產物連接到pMD18-T載體后，進行克隆并送南京金斯瑞生物科技有限公司進行測序。將測序獲得的16SrDNA基因序列在美國國家生物技術信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）的GenBank數據庫進行BLAST比對，根據序列同源性選取相似度較高的模式菌株，使用MEGA7.0的鄰接法（neighbour-joining，NJ）構建系統發育樹，確定所分離菌株的系統發育關系。

1.3.4 乳酸菌酒精耐受性的測定

將純化過的乳酸菌活化后，按照2%接種量接入不同乙醇體積分數（0、3%、5%、7%）的MRS液體培養基中，于37℃培養48 h，渦旋使菌體混勻后，使用V1800可見分光光度計測定培養液在波長600 nm處的吸光度值。

1.3.5 米酒制作工藝流程及操作要點

稱取500g糯米，蒸米并使用冷水淋冷后攤晾，接著將攤涼的糯米裝入米酒罐接入米酒發酵劑。未接菌處理發酵劑：安琪甜味型甜酒曲（4 g酒曲/kg糯米）；乳酸菌干預組發酵劑：安琪甜味型甜酒曲（4 g酒曲/kg糯米）與分離純化后的乳酸菌（使乳酸菌終濃度為105CFU/g糯米）MJ1-1、MJ1-2、MJ1-3、MJ2-1、MJ2-2、MJ3-1、MJ3-2、MJ3-3、MJ3-4、MJ4-1、MJ5-1、MJ5-2。將發酵劑與攤涼的糯米混勻并搭窩后進行米酒發酵制作，發酵溫度設置為30℃，時間為72 h。待米酒發酵完成后，即可處理樣品進行一系列生化指標測定。

1.3.6 米酒樣品生化指標測定

樣品pH值的測定：按照國標GB/T 13662—2008《黃酒》中方法進行測定；

可溶性固形物的測定：使用Abbemat350全自動折光儀進行米酒樣品可溶性固形物的測定；

有機酸的測定參照王丹丹等[14]的方法：取離心后的樣品上清，過0.45 μm濾膜后進樣對樣品有機酸進行測定。色譜條件：流動相使用正磷酸調pH=2.9的0.01 mol/L磷酸二氫鉀，柱溫設置為30℃，流速為1 mL/min，進樣體積為20μL，色譜柱：ZORBAXSB-AQ（4.6mm×250mm，5 μm）。

1.3.7 米酒樣品滋味測定

將發酵好的米酒混勻，添加等體積純水稀釋，稀釋后3000×g離心10min，取上清待用。將上清液按照王玉榮等[15]方法進行滋味測定：將6個傳感器電極使用陰、陽離子溶液洗滌，然后在參比溶液與待測米酒樣品中浸泡，測得的電勢差就是即為酸味、咸味、苦味、澀味、鮮味和甜味的強度值；測完基本味后，將電極洗滌30 s，再次使用傳感器C00，AE1和AAE測得苦、澀和鮮3個基本味回味的強度。

1.3.8 統計方法

使用配對t檢驗對對照組米酒與添加乳酸菌的米酒中可溶性固形物和pH值進行顯著性分析；使用主成分分析法（principlecomponentsanalysis，PCA）對米酒滋味進行分析；使用Origin 8.5作圖。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌分離鑒定

本研究從鳳窩酒曲樣品中共分離到12株乳酸菌，具體編號見表1。為確定這些乳酸菌的系統分類，測定了這12株乳酸菌的16S rDNA基因序列，并進行了NCBI BLAST同源性比對，比對結果見表1。同時使用MEGA7.0構建了系統發育樹，結果如圖1所示。

表1 分離菌株16S rDNA基因序列比對結果Table 1 Results of 16S rDNA gene sequences alignment of isolated strains

由表1、圖1可知，菌株MJ2-2、MJ3-1、MJ3-2、MJ3-3與短乳桿菌聚在一起，且這4株乳酸菌的16S rDNA基因序列與短乳桿菌模式菌株相似度在99%以上，因此確認這4株乳酸菌為短乳桿菌（Lactobacillusbrevis）。菌株MJ1-2、MJ1-3、MJ3-4與植物乳桿菌標準菌株在系統發育樹上聚在一起，確定為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）；MJ1-1為發酵乳桿菌（Lactobacillus plantarum）；菌株MJ5-1、MJ5-2、MJ2-1、MJ4-1等與融合魏斯氏菌JCM1093系統發育關系最近，鑒定為融合魏斯氏菌（Weissella confusa）。總的來說，分離到的12株乳酸菌分別屬于短乳桿菌、植物乳桿菌、發酵乳桿菌、融合魏斯氏菌4個菌種，歸于乳桿菌、魏斯氏菌兩個菌屬。

圖1 基于米酒曲中乳酸菌16S rDNA基因的系統發育樹Fig.1 Phylogenetic tree of lactic acid bacteria from rice wineJiuqu based on 16S rDNA genes

以往對甜米酒以及黃酒這種同樣以稻米為原料的釀造酒中乳酸菌的群落結構報道，除了本文中分離到的乳酸菌外，還報道了片球菌屬（Pediococcus）以及腸球菌屬（Enterococcus）的乳酸菌[16-18]，但是從鳳窩酒曲中并未分離到。

薏米的添加量是影響薏米雞肉餅風味和質地的因素之一，以不同的薏米添加量進行單因素試驗，確定其最佳添加量。試驗結果表明，薏米的添加量為20%時，薏米雞肉餅中有明顯的薏米香味，表明這個添加量使薏米雞肉餅的滋味和口感達到最佳。

2.2 酒精耐受性

許多發酵食品（如葡萄酒、黃酒、米酒等釀造酒類）本身含有一定量的乙醇。湖北省米酒標準為乙醇含量為1.5%vol～3.5%vol[19]。將分離到的12株乳酸菌分別接種到含有0、3%、5%、7%乙醇的MRS液體培養基中37℃培養48 h，檢測其在波長600 nm處的吸光度值，以確定這些乳酸菌在不同乙醇含量的MRS培養基中的生長狀況，具體結果如圖2所示。

圖2 分離菌株的酒精耐受性Fig.2 Resistance to ethanol of isolated strains

由圖2可知，隨著乙醇添加量的增加，總體上乳酸菌的OD600nm值顯著下降，表明乳酸菌生長呈現出一個下降趨勢，且所選擇的4種乙醇含量的MRS培養基中生長體現出極顯著的差異（P＜0.01），而乳酸菌在乙醇含量7%的條件下生長最差。在含3%乙醇的培養基條件下，分離到的乳酸菌均能較好的生長，表明米酒環境適合乳酸菌分離株的生長與代謝，可用于米酒的制作。

2.3 乳酸菌對米酒滋味的影響

取發酵好的米酒，使用電子舌對米酒的滋味進行評價，測定了接入乳酸菌組與未接菌對照組米酒樣品的酸味、苦味、澀味、咸味、鮮味5個基本味及豐厚度（鮮的回味）、后味A（澀的回味）、后味B（苦的回味）3個基本味回味指標。在測定中，將未接菌處理設為對照，其各滋味指標相對強度值定義為0，因此本研究中分析的各滋味指標的強度均為相對強度值。各組米酒樣品滋味測定結果如圖3所示。

圖3 米酒不同滋味的箱型圖Fig.3 Boxplot of the different taste of rice wine

由圖3可知，乳酸菌的添加對米酒的后味A、后味B和豐厚度的影響不顯著，即通過電子舌幾乎無法對這幾組米酒樣品作出識別。接入乳酸菌以后，米酒苦味、鮮味與咸味下降，酸味與澀味顯著提高（P＜0.01）。食品的酸味與有機酸含量與種類有關，所以在接下來的實驗中對米酒樣品的有機酸進行了分析。

2.4 不同菌株對米酒中有機酸的影響

米酒中有機酸由主要包括蘋果酸、檸檬酸、乳酸、乙酸、琥珀酸、草酸、酒石酸等。由圖4可知，總體上來說，米酒中乳酸（1.56～8.75 g/L）、乙酸（1.25～5.45 g/L）、琥珀酸（1.14～3.0 g/L）、蘋果酸（0～4.07 g/L）含量較高，其他有機酸含量較低。乳酸是乳酸菌代謝產生的主要有機酸。然而，接入乳酸菌MJ1-1、MJ4-1、MJ5-2、MJ2-1、MJ5-1處理的米酒乳酸含量均顯著低于未接菌組。接入乳酸菌MJ1-3樣品乳酸含量為8.75g/L，是未接菌組的1.79倍。另外琥珀酸為1.14g/L，是未接菌組的1.42倍。未接菌組樣品未檢測到檸檬酸，而接種MJ1-3樣品的檸檬酸含量為0.64 g/L，表明MJ1-3干預能提高米酒乳酸、琥珀酸及檸檬酸含量。

接種MJ2-2、MJ3-2、MJ3-3與MJ3-1的樣品的乙酸含量均高于4.0 g/L，遠高于未接菌處理的乙酸含量。除此之外，未接菌處理米酒樣品中未檢測到蘋果酸，而接菌處理樣品的蘋果酸含量均高于0.45 g/L，且樣品MJ3-3、MJ3-1的蘋果酸含量最多，高于3.7 g/L。與之相反，乳酸菌MJ2-1干預組的米酒樣品，其草酸、琥珀酸、乳酸、乙酸含量均顯著低于未接菌處理。米酒樣品的另一個顯著變化是，接入乳酸菌處理樣品酒石酸含量低于HPLC檢測限，而未接菌處理酒石酸含量為0.20 g/L。以上結果說明，接入乳酸菌能顯著改變米酒的有機酸組成。

圖4 米酒有機酸含量測定結果Fig.4 Determination results of organic acid contents of the rice wine

酸味是反應米酒口感的一項重要指標，糖酸比合適的米酒更能引起消費者的青睞。有研究認為，乳酸菌通過產生有機酸（如乙酸、丙酸、乳酸等）而對有害菌代謝與繁殖起到抑制作用，同時也能對發酵食品的滋味產生影響，因此可以通過乳酸菌的干預，來改善米酒的滋味與風味[8-9]。總體上來說，菌株MJ1-3屬于植物乳桿菌，適于用作米酒發酵劑來增加米酒的乳酸含量，改善米酒品質，而另一株乳酸菌MJ2-1屬于融合魏斯氏菌，可以用作米酒降酸以改善米酒口感。因此，菌株MJ1-3與MJ2-1均可用于米酒復合發酵劑開發。

2.5 酒曲分離菌對米酒可溶性固形物與pH的影響

圖5 米酒pH與可溶性固形物的箱形圖Fig.5 Boxplot of pH and soluble solid of the rice wine

基于米酒滋味品質主成分分析的因子載荷圖見圖6。由圖6可知，第一主成分由酸味、鮮度、苦味、豐度（鮮的回味）3個滋味基本味與一個基本味回味指標構成，其貢獻率為90.10%，第二主成分由咸味、澀味、后味A（澀的回味）、后味B（苦的回味）兩個滋味基本味和兩個基本味回味指標構成，其貢獻率為8.56%。

圖6 基于米酒滋味品質主成分分析的因子載荷圖Fig.6 Factors loading diagram based on PCA of the taste quality of the rice wine

基于主成分分析的不同處理米酒因子得分圖見圖7。不同種類的米酒樣品呈現出較為明顯的聚類趨勢，MJ1-2、MJ1-3、MJ3-4組米酒位于第一二象限，MJ2-1、MJ4-1、MJ5-1、MJ5-2組米酒位于第三四象限，短乳桿菌MJ2-2、MJ3-1、MJ3-2、MJ3-3組米酒位于象限的交界處，而發酵乳桿菌MJ1-1米酒則遠離這幾個聚集區，這從另一個方面也說明了添加相同種類的乳酸菌，對米酒產生相似的影響。

圖7 基于主成分分析的不同處理米酒因子得分圖Fig.7 Score chart of the rice wine with different treatment based on principle components analysis

3 結論

從湖北孝感市采集了5個鳳窩酒曲樣品，通過傳統可培養法，共分離到了12株乳酸菌。對這些乳酸菌進行了鑒定，結果顯示它們分別屬于短乳桿菌、植物乳桿菌、發酵乳桿菌及融合魏斯氏菌4個乳酸菌種，歸為乳桿菌與魏斯氏菌兩個乳酸菌屬。將這12株乳酸菌接入米酒進行米酒制作，發現它們對米酒的有機酸種類與含量、固形物含量以及米酒的滋味產生了顯著影響，但是對米酒pH影響不顯著。其中植物乳桿菌MJ1-3使米酒中的乳酸增加79%，而乳酸菌M2-1能顯著降低米酒中草酸、琥珀酸、乳酸及乙酸的含量。因此，乳酸菌MJ1-3與M2-1可用于調節米酒有機酸含量，是適合用于米酒復合酒曲開發的候選菌株。

[1]王丹丹，沈 馨，董 蘊，等.孝感鳳窩酒曲真菌多樣性評價[J].中國釀造，2017，36（11）：38-42.

[2]王小紅，王 瑩，趙 山，等.孝感鳳窩酒曲中根霉的分離及特性研究[J].中國釀造，2008，27（13）：21-24.

[3]王小紅，徐 康，趙 山.孝感鳳窩酒曲中酵母菌的分離及特性研究[J].現代食品科技，2008，24（2）：134-137.

[4]林 瑩，代道芳，辛志平，等.傳統培養結合分子生物學法分析傳統發酵食品中乳酸菌的多樣性[J].中國釀造，2011，30（2）：52-54.

[5]劉曉麗，燕平梅，陳永師，等.市場上發酵菜中乳酸菌數量的調查研究[J].中國釀造，2010，29（3）：156-159.

[6]杜靜芳，繆璐歡，白鳳翎，等.西式發酵香腸中乳酸菌菌相構成及其作用與功能研究進展[J].食品與發酵工業，2016，42（2）：275-281.

[7]蔡浚澤，張蘭威，付春梅，等.傳統米酒中產酸菌的分離篩選及其發酵性能的研究[J].中國釀造，2007，26（10）：23-26.

[8]夏九學，汪 欣，姜 甜，等.乳酸菌及其乳酸菌發酵食品[J].食品工業科技，2016，37（20）：36-39.

[9]王越男，孫天松.代謝組學在乳酸菌發酵食品和功能食品中的應用[J].中國乳品工業，2017，45（5）：27-31.

[10]SYNGAI G G,GOPI R,BHARALI R,et al.Probiotics-the versatile functional food ingredients[J].J Food Sci Technol,2016,53(2):921-933.

[11]相 飛.甜酒曲中微生物群落結構及辣蓼甜酒曲的制曲工藝研究[D].上海：上海海洋大學，2015.

[12]MVEOBIANG A,MESTDAGH M,PORTAELS F.DNA isolation from chloroform/methanol-treated mycobacterial cells without lysozyme and proteinase K[J].Biotechniques,2001,30(2):272-274.

[13]FANG Z G,YAO W C,LOU X Q,et al.Profile and characteristics of culturable airborne bacteria in Hangzhou,southeast of China[J].Aerosol Air Qual Res,2016,16(7):1690-1700.

[14]王丹丹，凌 霞，王 念，等.基于電子舌技術對市售生抽醬油滋味品質的評價[J].食品與發酵工業，2017，43（6）：244-249.

[15]王玉榮，張俊英，胡欣潔，等.湖北孝感和四川成都地區來源的酒曲對米酒滋味品質影響的評價[J].食品科學，2015，36（16）：207-210.

[16]LUAN T Q,LI Z J,ZHONG Q D,et al.Preliminary study of changes of the bacterial community structures during the rice wine fermentation[J].Sci Technol Food Ind,2013,34(12):177-180.

[17]LV X C,WENG X,ZHANG W,et al.Microbial diversity of traditional fermentation starters for Hong Qu glutinous rice wine as determined by PCR-mediated DGGE[J].Food Control,2012,28(2):426-434.

[18]焦晶凱.傳統釀造米酒微生物多樣性及優勢菌特性的研究[D].哈爾濱：哈爾濱工業大學，2012.

[19]蔡 敏，李紀亮，楊新河，等.3種米酒曲發酵成品質量分析[J].食品研究與開發，2016，37（20）：1-4.