不同貯存期高溫大曲中乳酸菌的多樣性及其耐受性分析

吳正坤，繆禮鴻*，張明春，周鳳鳴

（1.武漢輕工大學 生物與制藥工程學院，湖北 武漢 430023；2.湖北白云邊酒業股份有限公司，湖北 松滋 434200）

高溫大曲是醬香型白酒和濃醬兼香型白酒生產上大量使用的一種由自然接種、高溫發酵而制成的菌酶合一發酵劑[1]。大曲中的微生物種類及數量是影響白酒發酵的重要因素，其中乳酸菌的數量及種類也是其中重要的一環。乳酸菌通過同型乳酸發酵和異形乳酸發酵產生的乳酸、乙酸、二氧化碳、乙醇及細菌素等在抗菌防蟲等方面有著巨大的優勢[2]。在探究大曲中微生物的群落結構時，非培養技術被廣泛應用[3-5]。杜海等[6-7]的研究中，利用高通量測序技術，探究了發酵產物風味會隨著貯存期間微生物結構的變化而變化。由于高溫大曲中乳酸菌數量較少且種類繁復，導致基因組難以抽提，目前沒有針對高溫大曲貯存期間中乳酸菌菌落結構變化的研究。

本研究利用高通量測序技術對不同貯存期的高溫大曲中乳酸菌菌落結構進行了分析，同時采用傳統分離方法從大曲中分離獲得乳酸菌菌株，并比較了不同菌株的耐受能力，為探究高溫大曲貯藏期間乳酸菌的演替規律提供依據及菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源

高溫大曲曲粉均由湖北白云邊酒業股份有限公司提供。

1.1.2 試劑

脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate，dNTP）、脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）聚合酶（PowerTaq酶）、DL2000 DNA Marker：寶生物工程（大連）有限公司；聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）引物、Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒：生工生物工程（上海)股份有限公司；PowerSoil DNA Isolation Kit：美國Mobio公司；酵母提取物、胰蛋白胨（均為生化試劑）：英國Oxoid公司；溶菌酶（20 000 U/mg）：蓋云天（武漢）生物技術有限公司；其余試劑均為國產分析純。

1.1.3 培養基

MRS培養基：蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、酵母膏5 g、葡萄糖5 g、吐溫-80 1 mL、磷酸氫二鉀2 g、無水乙酸鈉5 g、檸檬酸氫二銨2 g、七水合硫酸鎂0.2 g、水合硫酸錳0.05 g、蒸餾水1 000 mL pH值調至6.5～6.8。

固體MRS培養基：在液體MRS培養基中加入瓊脂粉20 g。

富集培養基：將液體MRS培養基的pH值分別調至4.0、5.0、6.0，即酸性MRS培養基。

平板分離培養：采用固體MRS培養基。

改良MRS培養基：蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、酵母膏5 g、葡萄糖20 g、吐溫80 1 mL、磷酸氫二鉀2 g、無水乙酸鈉5 g、檸檬酸氫二銨2 g、七水合硫酸鎂0.58 g、水合硫酸錳0.25 g、結冷膠20 g、蒸餾水1 000 mL，pH調至6.5～6.8[8]。

LB液體培養基：胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、氯化鈉10 g、蒸餾水1 000 mL，pH值調至7.0。

碳酸鈣培養基：在固體MRS培養基中加入20g碳酸鈣。

耐受性培養基：在液體MRS培養基的基礎上調整其pH為2.5～4.5，滅菌后將乙醇體積分數分別調節為2%、4%、6%、8%、10%（V/V）。

以上培養基滅菌條件均為1.0×105Pa，滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

T100-Thermal Cycler PCR儀：美國BIO-RAD公司；5424BQ848019小型臺式高速離心機：艾本德中國有限公司；ECLIPSE 80i顯微鏡：日本尼康公司；ZHJH-C1115B超凈工作臺、ZXSD-A1270恒溫培養箱：上海智城分析儀器制造有限公司；ZQLY-300F振蕩培養箱：上海知楚儀器有限公司；DYY-6C電泳儀：北京六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

隨機抽取10份貯存期分別為0d、30d、60d、90d、120d、150 d的粉碎曲粉，混合均勻并過20目篩后備用。

1.3.2 不同貯存期大曲中乳酸菌數量的變化

稱取0 d、30 d、60 d、90 d、120 d、150 d大曲樣品各10 g分別置于90mL無菌水中，于34℃、170r/min振蕩30min。采用稀釋平板涂布法測定各樣品中乳酸菌數量。

1.3.3 緩沖液的配制

抽提緩沖液：200 mmol/L Tris-Base，50 mmol/L乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA），200 mmol/L NaCl，10 mmol/L CaCl2。

溴化十六烷三甲基銨（cetyl trimethyl ammonium bromide，CTAB)溶液：5%CTAB，1.5 mol/L NaCl。

1.3.4 基因組的抽提

稱取30 d、60 d、120 d大曲樣品各50 g分別置于100 mL抽提緩沖液中，添加玻璃珠數顆，室溫180r/min振蕩60min。使用滅菌紗布過濾至50 mL離心管中，室溫8 000 r/min離心5 min，棄上清保留沉淀。向帶有沉淀的離心管中加入10 mL抽提緩沖液，200 μL溶菌酶（100 mg/mL），400 μL蝸牛酶（200mg/mL）以及玻璃珠和石英砂，37℃搖床振蕩1 h。加入20%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）溶液1.25 mL，5%溴化十六烷三甲基銨（CTAB）溶液600 μL，5mol/LNaCl溶液1.8mL，混勻后65℃水浴1h，室溫8000r/min離心10 min，收集上清。向上清中加入1/2體積的苯酚∶氯仿∶異戊醇=25∶24∶1（V/V），渦旋振蕩混勻后室溫12 000 r/min離心5 min。取上層水相于新的離心管中，加入1/10體積的醋酸鈉溶液（3 mol/L，pH=5.2），2倍體積的無水乙醇，混勻后于-20℃冰箱靜置30 min。12 000 r/min離心10 min，丟棄上清保留沉淀，使用無菌水將其溶解。最后使用土壤DNA抽提試劑盒對溶液進行純化操作。

1.3.5 基因組PCR擴增及高通量測序

利用引物515F（5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′）和806R（5′-GGACTACCAGGGTATCTAAT-3′）對細菌的16SrDNAV4區序列進行PCR擴增。PCR反應體系（共20μL）：5×FastPfu緩沖液4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，上、下游引物各0.8 μL（5 μmol/L），FastPfu聚合酶0.4 μL，模板DNA 10ng，用三重蒸餾水（dddH2O）補足至20μL。PCR反應程序為：95℃預變性3 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，27個循環；72℃再延伸10 min。每個PCR樣本設置3個平行，所得產物混合后采用2%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，最后通過Illumina HiSeq測序平臺，對擴增產物進行高通量測序[9-10]。

1.3.6 序列數據處理與分析

得到的高通量測序數據截去Barcode和引物序列后使用FLASH（1.2.7）[11]對每個樣品reads進行拼接，得到的拼接序列為原始數據（Raw Tags）；經過嚴格的過濾處理[12]得到高質量的Tags數據（CleanTags）；參照Qiime（1.7.0）[13]的Tags質量控制流程處理后得到的Tags需要進行去除嵌合體序列的處理，Tags序列通過（UCHIME Algorithm）[14]與數據庫（Gold database）進行比對檢測嵌合體序列，并最終去除其中的嵌合體序列[15]，得到最終的有效數據（Effective Tags）。利用Uparse軟件（Uparse v7.0.1001）[16]對所有樣品的全部Effective Tags進行聚類，默認以97%的一致性（Identity）將序列聚類成為操作分類單元（operational taxonomic units，OTUs），同時會選取OTUs的代表性序列，依據其算法原則，篩選OTUs中出現頻數最高的序列作為OTUs的代表序列。

1.3.7 乳酸菌的富集

稱取30 d、60 d、120 d大曲曲粉各5.0 g，每組貯存期一組平行，加入pH值分別為4.0、5.0、6.0的100 mL富集培養基中，于34℃富集2 d。

1.3.8 乳酸菌的初篩

采用稀釋涂布平板法將不同的富集液劃線于碳酸鈣平板上進行分離純化，選擇碳酸鈣平板上產生水解圈的菌株，進行革蘭氏染色和過硫化氫實驗，將革蘭氏染色呈陽性且過硫化氫實驗呈陰性的菌株初步確定為乳酸菌。

1.3.9 乳酸菌的分子生物學鑒定

按照Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒說明書抽提初篩得到的乳酸菌的基因組，于-20℃保存備用。以不同乳酸菌的基因組DNA為模板，采用16S rDNA的通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3）'與1492R（5'-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3）'，PCR擴增不同乳酸菌的16S rDNA序列。

PCR反應體系：2×PowerTaqMaserMix 25 μL，DNA模板1 μL，引物各1 μL，dddH2O 22 μL。

PCR擴增條件：94℃預變性5 min；94℃變性50 s，54℃退火50 s，72℃延伸90 s，30個循環；72℃再延伸10 min。

PCR產物的檢測：吸取5 μL PCR產物，利用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。選擇1 400 bp左右的16S rDNA PCR產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.3.10 乳酸菌生長曲線

菌株活化：將菌株pH4-1、JD-1、H3-1、P3-1、yx-6、yx-8接種于10mL液體MRS培養基，于34℃、170r/min振蕩培養12h。

生長曲線繪制：將液體活化后的不同乳酸菌吸取100μL接入10 mL液體MRS培養基中，于34℃、170 r/min條件下搖床培養，前12 h每隔2 h取樣，后續每隔4 h取樣，測定樣品在波長600 nm處吸光度值，繪制乳酸菌的生長曲線。

1.3.11 乳酸菌耐受性實驗

根據酒醅環境pH值3.5～4.5，45℃左右堆積發酵溫度，設定耐受性范圍。

耐溫性實驗；將經液體活化后的乳酸菌菌株按106CFU/mL分別接入液體MRS培養基中，分別于37℃、42℃、45℃、48℃，170 r/min條件下培養24 h，測定波長600 nm處的吸光度值。

耐酸性實驗：將經液體活化后的乳酸菌菌株按106CFU/mL分別接入pH值為2.5、3.0、3.5、4.0、4.5的液體MRS培養基中，于34℃、170 r/min條件下培養24 h，測定波長600 nm處的吸光度值。

耐乙醇實驗：將經液體活化后的乳酸菌菌株按106CFU/mL分別接入乙醇體積分數為0、2%、4%、6%、8%、10%的液體MRS培養基中，于34℃、170 r/min條件下培養24 h，測定波長600 nm處的吸光度值。

2 結果與分析

2.1 不同貯存期大曲中乳酸菌數量的變化

不同貯存期大曲中乳酸菌數量結果見表1。由表1可知，高溫大曲貯存過程中，乳酸菌的數量由完成制曲時（0 d）1.7×104CFU/g增長至30 d時1.4×105CFU/g，最終貯存至120 d時乳酸菌數量達到最大值（7.6×105CFU/g），相比完成制曲時增長了43.71倍。說明在大曲貯存過程，并不是簡單的放置，其中存在的微生物可能存在復蘇或生長代謝[17]。選擇變化較為突出的30 d、60 d、120 d樣品進行高通量測序，對乳酸菌數量變化進行分析。

表1 不同貯存期大曲中乳酸菌數量變化情況Table 1 Changes of lactic acid bacteria in Daqu from different storage periods

2.2 不同貯存期大曲高通量測序結果分析

不同貯存期大曲高通量測序結果見表2。由表2可知，30 d、60 d、120 d大曲細菌高通量測序結果經過拼接后分別獲得52 438、63 433、53 933條Raw Tags，過濾低質量和短長度的序列后分別得到47596、57583、48908條CleanTags，最終過濾嵌合體后得到可用于后續分析分別得到44 733、50 894、35 363條Effective Tags。

表2 數據處理結果Table 2 Data processing results

為了研究樣品的物種組成多樣性，對所有樣品的Effec tiveTags進行聚類，以出現頻數最高的作為該OTUs的代表序列，然后對OTUs的代表序列進行物種注釋，BLAST后抽離出占比超過0.1%的乳酸菌，結果如表3所示。由表3可知，總共獲得12個OTUs，共有5 106條有效序列，高通量測序共發現5個屬，分別為乳桿菌屬（Lactobacillus）、乳球菌屬（Lactococcus）、腸球菌屬（Enterococcus）、片球菌屬（Pediococcus）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）。在大曲貯存過程中，乳酸菌OTUs總頻數由2 321（30 d）下降至1 290（60 d），120 d時升高至5 106，且乳酸菌在細菌總體中所占比例由4.89%（30 d）下降至2.24%（60 d），120 d時升高至14.45%，與乳酸菌貯存期數量變化結果呈正相關。結果表明，在不同貯存期高溫白酒大曲中乳酸菌的菌數和群落結構隨著貯存期的增加有著顯著的變化，與于文娟等[18]研究結果一致。相較其他時期，大曲在貯存在60 d時乳酸菌在細菌整體中并不占優勢。大曲中復雜的微生物菌群在復蘇或生長代謝的過程中也有不同菌種間相互作用。經過120 d貯存后隨著大曲中微生物群落結構趨于穩定，其中優勢乳酸菌繼續復蘇或生長代謝，乳酸菌數量在120 d達到峰值。有研究認為乳酸菌在貯存過程中并不是簡單的休眠或者衰亡，而是在利用自身異養厭氧的特性進行緩慢的生長繁殖[19]，其中過程有待進一步考證。

表3 高通量測序中乳酸菌OTU測定結果Table 3 Determination results of OTU of lactic acid bacteria by high-throughput sequencing

對不同貯存期乳酸菌各OTUs所占比例進行分析，結果見圖1，對所抽提出的OTUs制作系統進化樹，結果見圖2。由圖1可知，貯存期為30 d、60 d、120 d的高溫白酒大曲中，主要的乳酸菌是格氏乳球菌（Lactococcusgarvieae），在三個不同貯存期大曲乳酸菌中都占有著最大的比例，分別占比66.31%、47.75%、47.18%。隨著貯存期的延長，格氏乳球菌（Lactococcus garvieae）在乳酸菌中所占比例先降低后趨于平穩，與乳酸菌整體數量和在細菌中占比結果相對應。

圖1 不同貯存期乳酸菌各OTU所占比例Fig.1 Proportion of each OTU of lactic acid bacteria in different storage period

由圖2可知，共計12個OTUs分為4個分支，第一個分支為均為乳桿菌屬（Lactobacillus），其中包含6個OTUs，分別為OTU13、OTU73、OTU5、OTU1、OTU4、OTU20；第二個分支為乳球菌屬（Lactococcus）及親緣關系較近的腸球菌屬（Enterococcus）共4個OTUs，分別為OTU6、OTU12、OTU107、OTU79；第三個分支為雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）僅有1個OTUs，為OTU28；第四個分支為片球菌屬（Pediococcus）OTU33，親緣關系最遠，即為外族。

圖2 高通量測序序列鄰接法構建的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on high-throughput sequences by Neighbor-Jointing method

2.3 大曲中乳酸菌的初篩

通過富集培養、平板劃線分離等方法總共獲得84株菌株，其中革蘭氏陽性菌53株，經過硫化氫實驗，初步確定乳酸菌共18株，編號為pH4-3、JD-1、JD-2、JD-3、JD-4、JD-5、H3-1、P3-1、J0-1、J0-4、yp-1、yp-2、yx-1、yx-2、yx-5、yx-6、yx-7、yx-8。經過鏡檢觀察，其中8株球菌，10株桿菌。

2.4 大曲中乳酸菌的分子生物學鑒定

為了進一步確定所篩菌株具體的親緣關系與進化關系，對所篩菌株的16S rDNA序列進行分析，在美國國立生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）網站，采用BLAST搜索相似序列，利用Bioedit進行多序列比對，使用MEGA5.2生物學軟件的鄰接法（neighbor-joining，NJ）構建系統發育樹，所構建的系統發育樹如圖3所示。

圖3 基于16S rDNA序列構建的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences

由圖3可知，分離獲得的18株菌株，其中植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）7株（JD-1、JD-2、JD-3、JD-4、JD-5、J0-1、J0-4）；乳酸片球菌（Pediococcuslolii/Pediococcus acidilactici）1株（pH4-3）；糞腸球菌（Enterococcus faecalis）6株（P3-1、yp-1、yp-2、yx-1、yx-2、yx-5）；融合魏斯氏菌（Weissella confusa）1株（H3-1）；臺灣乳球菌（Lactococcus formosensis）1株（yx-8）；格氏乳球菌（Lactococcus garvieae）2株（yx-6、yx-7）。

平板分離中獲得的乳酸菌主要為植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum）和糞腸球菌（Enterococcusfaecalis），而不是高通量測序中顯示的格氏乳球菌（Lactococcusgarvieae）。分析原因認為，植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）和糞腸球菌（Enterococcus faecalis）在稀釋平板上適應性較強，在直接涂布時競爭處于優勢地位，以至于其他菌種較難分離得到。而通過加入硫酸錳、硫酸鎂及結冷膠進行富集培養的方式，針對性得篩選大曲高通量測序中占比較少（不足0.1%）的乳酸菌，得到在高溫大曲乳酸菌占比較大的格氏乳球菌（Lactococcus garvieae）。

2.5 部分乳酸菌株的耐受特性分析

在本研究中首次分離得到在高通量測序中占優勢的格氏乳球菌，格氏乳球菌代謝產生的廣譜細菌素在極端環境下都有較高的生物穩定性[20-21]。在酒醅高溫、高乙醇和低pH環境中仍然可以發揮作用。分離到的融合魏斯氏菌在芝麻香型白酒發酵過程中被檢測到[22]。乳酸片球菌在白酒大曲中報道較多，清香型大曲中檢測得到[23]，在中溫大曲中分離到的乳酸片球菌具有產酸快，耐受性好的特點[24]。對比中低溫大曲中分離的乳酸片球菌，菌株pH4-3在pH 3.5條件下可以生長，且47℃高溫下仍保持較高的生物活性，與高溫大曲在制曲時高溫發酵有密切關系。植物乳桿菌及糞腸球菌相關報道較多，應用相對廣泛。由于菌株同源性較高，同一菌種選擇一株繪制生長曲線、進行耐溫、耐酸、耐乙醇特性實驗，分別為菌株pH4-3、JD-1、H3-1、P3-1、yx-6、yx-8，結果見圖4。

由圖4可知，菌株pH4-3的生長情況優于其他菌株，于20 h時OD600nm值達到2.18，遠高于其他菌株，在pH值為3.5、47℃高溫條件下能夠生長代謝，4%vol酒精度條件下OD600nm值為1.627，6%vol酒精度下OD600nm值為0.787；菌株JD-1的耐乙醇、耐酸特性相對良好，酒精度為8%vol乙醇環境（OD600nm值為1.691）和pH值為3.5（OD600nm值為1.493）的酸性環境中生長良好，耐溫特性較差（42℃時OD600nm值為0.38）；菌株H3-1在高溫、低pH值生長狀況一般（42℃條件下OD600nm值為0.41，pH值為4.0時，OD600nm值為1.244），僅能夠耐受4%vol酒精度（OD600nm值為1.818）；菌株P3-1可以耐受6%vol酒精度（OD600nm值為1.933），但僅能耐受pH值4.0的環境（OD600nm值為0.996），42℃條件下生長狀況較差（OD600nm值為0.51）；菌株yx-6在37℃條件下生長較差（OD600nm值為0.38），僅能耐受pH值為4.5的液體環境（OD600nm值為1.183），但在酒精度8%vol環境下具有較強耐受能力（OD600nm值為0.981）；菌株yx-8在溫度（42℃條件下OD600nm值為0.31）、乙醇（4%vol酒精度條件下OD600nm值為0.867）和pH（pH值4.5條件下OD600nm值為1.285）耐受實驗中并未表現出顯著耐受性。

圖4 不同乳酸菌的生長曲線(A)、耐溫(B)、耐乙醇(C)和耐酸(D)特性結果Fig.4 Results of growth curves(A),resistant curves of temperature(B),ethanol(C)and acid(D)of different lactic acid bacteria

綜合高通量測序結果，乳酸片球菌pH4-3綜合耐受性優于其他菌株，大曲中優勢菌株yx-6各方面耐受性并不突出，高溫大曲貯存期間中各乳酸菌占比變化情況與菌株純培養溫度、pH、乙醇耐受能力相關性不顯著。分析原因認為，高溫大曲環境水分低，且與其他微生物間存在相互作用[25]，耐受性實驗純培養環境不能完全模擬高溫大曲環境導致。

3 結論

高溫大曲貯存過程中，乳酸菌的數量先減少再增加。通過高通量測序方法從大曲中共鑒定出5個屬，分別為乳桿菌屬（Lactobacillus）、乳球菌屬（Lactococcus）、腸球菌屬（Enterococcus）、片球菌屬（Pediococcus）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium），其中格氏乳球菌（Lactococcus garvieae）在各貯存期大曲乳酸菌中占比最高（30 d時66.31%；60 d時47.75%；120 d時47.18%）。本實驗結果中貯存至60 d時乳酸菌菌群整體受到抑制，而貯存至120 d時，乳酸菌數量和占比大幅增加，認為可能存在微生物菌群的相互作用，從而影響乳酸菌在高溫大曲中的數量和占比。

實驗通過富集培養得到高通量測序相結合的方法，從高溫大曲中共分離、鑒定出18株乳酸菌，包括2株高溫大曲中優勢乳酸菌格式乳球菌（Lactococcus garvieae）。其中植物乳桿菌JD-1的耐乙醇、耐酸特性相對良好。融合魏斯氏菌H3-1在高溫、低pH值生長狀況一般，僅能夠耐受4%vol酒精度；糞腸球菌P3-1可以耐受6%vol酒精度，但僅能耐受pH值4.0的環境；格氏乳球菌yx-6在所有MRS培養基中生長狀況都不理想；臺灣乳球菌yx-8在溫度、乙醇耐受實驗中并未表現出顯著耐受性。綜合乳酸菌計數、高通量測序、純培養菌株耐受性對比的結果，乳酸菌在高溫大曲貯藏期間的變化與純培養菌株耐受性間無直接相關性，其耐受性差異可能不是影響大曲貯藏期間乳酸菌菌群演替的主要因素。參考文獻：

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