產細菌素乳酸菌菌株的來源及所產細菌素的分類研究進展

劉 靜，楊富民，白斌芳，郭 鋅

（1.甘肅農業大學 食品科學與工程學院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省食品檢驗研究院，甘肅 蘭州 730030）

微生物代謝產物作為天然防腐劑的重要來源，因其低成本、短周期等優點而受到致力于開發安全無毒、抑菌范圍廣天然防腐劑科研工作者的青睞。細菌素作為具有抑菌活性的乳酸菌代謝產物，研究發現，其對很多導致食源性疾病的致病菌和腐敗菌均具有抑制作用。實踐證明，在各種微生物產生的細菌素中，由乳酸菌產生的細菌素是最具有防腐應用潛質的，故而引起了諸多研究者的關注，在食品儲存和保鮮中多有應用。

目前，隨著研究的深入，越來越多的細菌素被發現，已被鑒定的有Nisin、Lactacin、Lactocin、Helveticin、Fermenticin、Sakecin等，其中研究最早、最成熟的當屬乳酸鏈球菌素即Nisin，其是目前得到許多國家認可并且已經應用于食品儲存和保鮮中的天然食品防腐劑，我國于1992年將其列入相應的國標中，但后來研究發現，Nisin只能抑制由革蘭氏陽性菌導致的食品腐敗，對革蘭氏陰性菌引起的腐敗無能為力。因此繼續發掘和篩選高效廣譜的細菌素已然成為近年來科學家們努力的方向。

為了便于科研工作者更好的開發抑菌譜廣、抑菌效果好的細菌素，本文在查閱文獻資料的基礎上，對產細菌素乳酸菌菌株的來源食品、菌株的所屬種屬、細菌素的分類以及分離純化方法等做一評價，為相關的研究提供基礎材料和參考，促進天然防腐劑的開發工作更好更快地開展。

1 產細菌素乳酸菌菌株的食品來源

產細菌素乳酸菌大多來源于發酵食品，包括動物性發酵食品（如牦牛酸奶、酸馬奶、奶渣、奶酪、干酪、風干腸、火腿等）和植物性發酵食品（如泡菜、發酵蔬菜汁、醪糟、老陳醋等），此外也有分離自動物腸道和糞便及變質食品的。

1.1 產細菌素乳酸菌菌株的動物性發酵食品來源

目前，關于從傳統動物性發酵食品中分離乳酸菌細菌素的報道多為乳制品，有分離自自然發酵牦牛奶制品的如牦牛酸奶[1]、奶酪、奶渣等，楊吉霞等[2]從牦牛奶酪中篩選出具有廣譜抗菌性的Y13、X29和X30共3株乳酸菌；周佳等[3]從牦牛奶渣中分離出了對熱很穩定的產細菌素腸球菌SAU-2；賀銀鳳等[4]從內蒙古地區酸馬奶酒中分離出兩株產細菌素腸球菌BY-3-2和SQ-3-2，經鑒定菌株BY-3-2為屎腸球菌（Enterococcus faecium），菌株SQ-3-2為耐久腸球菌（Entercoccus durans）；另外，干酪中也能分離乳酸菌細菌素，LOZO J等[5]從自然發酵的干酪中分離到的菌株Lacto bacillus paracaseisubsp.paracaseiBGBUK2-16，能夠產生具有抑菌作用的細菌素，CARIDI A等[6]從來自于干酪和生羊奶的225株乳酸菌中分離到了1株Lb.paracasei，該菌對Escherichia coli有很強的抑制作用；研究表明，風干腸及火腿制品也能分離出乳酸菌細菌素[7]，劉麗等[8]從一種火腿制品中分離篩選到1株具有抑菌活性的乳酸菌菌株LH-09，鑒定為植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum），CASTROM P等[9]從發酵香腸中分離出一株產細菌素干酪乳桿菌，并研究了影響其細菌素產量的因素。

1.2 產細菌素乳酸菌菌株的植物性發酵食品來源

產細菌素乳酸菌的植物性來源大多為泡菜[10-13]，也有報道從陳醋中可分離產細菌素菌株[14]，發酵蔬菜汁中也可以分離出乳酸菌素，胡美忠等[15]從農家自制酸蘿卜、酸白菜、酸辣椒、酸豇豆等發酵蔬菜汁中分離純化出了兩種新型細菌素Plantaricin 163和Plantaricin 163-1；易華西等[16]也曾報道從自制的發酵蔬菜汁-漿水中分離出了產細菌素菌株；閔鐘熳等[17]從自制的發酵胡蘿卜汁、泡菜汁、黃瓜汁、黃豆汁、綠豆汁中分離篩選出1株乳酸菌，確定為鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）；劉書亮等[18]從醪糟中篩選出的P185對多數的革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌及一些真菌均具有較強抑制作用。

1.3 其他來源

除來自動植物的產細菌素乳酸菌菌株外，近年來也有報道其他來源的，趙鴨美等[19]從南海海域中捕撈的華貴櫛孔扇貝腸道中分離到9株乳酸菌，篩選出1株產細菌素的乳酸菌菌株ZH-54，經鑒定，為堅強腸球菌（Enterococcus durans）；侯運華等[20]從雞腸道分離篩選出一類具有廣譜抑菌活性的類細菌素物質，對溶壁微球菌（Micrococcus Lysodeikticus）、金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）等有強烈抑制作用；張小美等[21]從嬰兒糞便中分離得到1株產抑菌活性物質菌株，確定為干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）LZ55，能夠抑制多種革蘭氏陽性菌和陰性菌；王小娜等[22]也從嬰兒糞便中分離出一株具有抗菌活性的乳酸菌，命名為Lactobacillus plantarum ZJ317；雷虹等[23]對分離自酸菜的一株產細菌素乳酸菌進行了鑒定，發現該菌株為副干酪乳桿菌，并通過實驗證明，該菌株也可以從嬰兒糞便、變質的啤酒中分離出來。

2 產細菌素乳酸菌菌株的種屬

自1908年METCHNIKOFFE報道了乳酸桿菌能抑制非腸道微生物以來，由乳酸菌產生的抑菌活性物質被廣泛研究，至今已經發現至少8個不同屬乳酸菌可以產生抑菌活性物質。主要有乳桿菌屬（Lactobacillus）、乳球菌屬（Lactococcus）、明串珠菌屬（Leuconstoc）、腸球菌屬（Enterococcus）、片球菌屬（Pediococcus）、鏈球菌屬（Streptococcus）、肉食桿菌屬（Carnobacterium）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）等。

2.1 乳桿菌屬產細菌素

乳桿菌屬是目前報道產細菌素最多的乳酸菌屬，已知的乳桿菌屬細菌素有plantaricin A、B、C、E、F、K、J、S、T、BN、C19、423、Wα、Wβ、ASM1、NC8β、NC8α、Sα、Sβ、ZJ5；acidocin A、B、J1132β、8912、LF221B；sakacin A、M、G、P；bavaricin MN、A；lactocin F、S、27、705；curvacin A；curvalicin 28a、28b、28c；curvaticin FS47、L442；gassericin A、T；brevicin；helventicin J、V-1829；cascicin 80；fermrnticin；reutericin 6；rhamnosin A；lactacin F、B等。部分乳桿菌屬細菌素的來源見表1。

表1 部分乳桿菌屬細菌素的來源Table 1 Sources of part of bacteriocins fromLactobacillus

2.2 乳球菌屬產細菌素

目前，已知的乳球菌屬所產細菌素有lactococcin A、actococcin GJ-9、lactococcin BZ、lactococcin 972、lactococcin R以及由Lactococcus lactisKLDS4.0326和Lactococcus raffinolactisY-12產生的兩種未命名的細菌素。

2.3 明串珠菌屬產細菌素

ORBERG P K等[34]在1984年報道了3株腸膜明串珠菌葡聚糖亞種（Leuconostoc mesenteroidessubsp.dextranicum）和2株未知明串珠菌產生的細菌素，這成為明串珠菌產細菌素的較早報道。目前，已報道的明串珠菌細菌素有mesenterocin5、mesenterocin52A、mesenterocin 52B、leucocin C、leuconocin S等。

2.4 腸球菌屬產細菌素

屎腸球菌和糞腸球菌是腸球菌中產細菌素報道最多的種。GIRAFFA G等[35]發現奶酪中存在產細菌素腸球菌7C5，經鑒定，為Enterococcusfaecium；CASAUSP等[36]報道屎腸球菌T136可同時產生腸球菌素EnterocinA和EnterocinB；趙鴨美等[19]從華貴櫛孔扇貝腸道中分離篩選出1株具有較強抑菌作用的乳酸菌ZH-54，經鑒定，為堅強腸球菌（Enterococcus durans）。

2.5 片球菌屬產細菌素

片球菌素是由片球菌屬種的乳酸片球菌、啤酒片球菌和戊糖片球菌3種菌產生的。目前，已報道的片球菌素有pediocinAcH、pediocinPA-1、pediocinA、pediocinSJ-1pediocin PD-1及由P.cervesiaeFBB63和P.acidlacticiPC產生的兩種未命名的細菌素[37]。

2.6 鏈球菌屬產細菌素

目前已經發現的鏈球菌屬細菌素有Salivaricin A、Salivaricin A2、Salivaricin B、Salivaricin E、Salivaricin G32等羊毛硫抗菌肽細菌素。

2.7 肉食桿菌屬產細菌素

肉食桿菌屬中已知的細菌素有carnobacteriocinsA1、A2、A3，carnocin U149、carnocin KZ213、carnocin 54、carnocin H、carnobacteriocins B1、B2及由C.piscicolaLK5產生的一種未命名的細菌素。

2.8 雙歧桿菌屬產細菌素

已發現少數雙歧桿菌屬菌株也可以產生細菌素，如兩歧雙歧桿菌NCFB1454[38]、嗜熱雙歧桿菌RBL67[39]、嬰兒雙歧桿菌BCRC14602[40]、動物雙歧桿菌BB04[41]等。

3 細菌素的分類

由于細菌素的種類很多，故可以依據不同的分類標準進行分類。結果見表2。

表2 細菌素的不同分類方法及結果Table 2 Classification methods and results of bacteriocins

4 細菌素的分離純化

細菌素是乳酸菌在代謝過程中由其核糖體合成機制產生的具有抑菌活性的多肽，因此，可以根據多肽的理化特性優化細菌素的分離純化方法。目前，沒有一套成型通用的細菌素分離純化方法，需根據其多肽的性質、產細菌素菌株的來源及特性設計純化的策略。在大量研究的基礎上，可以將細菌素的分離純化大致歸為三個步驟：粗分離、中度純化和精制。

4.1 粗分離

粗分離的產物純度在1%左右。目前，常用的方法有沉淀法（鹽析法-最常用的是硫酸銨沉淀法、低溫有機溶劑沉淀法、等電點沉淀法）、有機溶劑萃取法（最常用的溶劑是丙酮）、吸附法（pH吸附法、菌體吸附法）、透析法、熱變性法和超濾法等。可以根據實驗條件和要求的不同，使用一種或幾種方法混合使用對上清液進行粗提，如果不了解將要純化的細菌素性質，建議使用硫酸銨分級沉淀較好，如果對純度要求較高，可以多種方法結合使用。

4.2 中度純化

此階段目的是去除大量雜質，使細菌素純度達到50%～90%。較成熟的純化方法有凝膠過濾層析、離子交換層析、疏水交換層析和親和層析。離子交換層析是低鹽吸附、高鹽洗脫，疏水交換層析則是高鹽吸附、低鹽洗脫，因此，離子交換層析后的高鹽樣品若直接采用疏水交換層析是最為高效的組合，如PILAR C等[47]在純化細菌素Enterocin A、B時就選擇了在離子交換層析后使用疏水層析的方法，效果較佳。

4.3 精制

此階段要使細菌素純度達到99%，大多采用反相高效液相色譜（reversed-phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）進行純化，最常用的色譜柱為反相C18柱，流動相多使用乙腈、異丙酮或甲醇，終產品可以用氨基酸自動分析儀分析氨基酸組成，用基質輔助激光解吸附電離飛行時間質譜儀分析分子質量。

在不知道細菌素組成的情況下，一般采用上述三個步驟依次純化，也有報道僅用兩步就能達到純化目的，SONIAC等[48]通過2次RP-HPLC純化就得到了純品；UTENG M等[49]建議兩步法提純Ⅱa類細菌素，主要是利用SP-Sepharose Fast Flow陽離子交換柱吸附帶正電荷的細菌素，然后再利用反相液相色譜回收。

最近的研究表明，免疫親和層析法能快速純化細菌素，如有報道將單克隆抗體antinisinA偶聯到HiTrapN-羥基活化柱上，成功實現了一步純化[50]，目前，一些特殊的抗體（如enterocin B，nizin Z，pediocin PA-1和enterocin P）已經用于細菌素的純化和檢測[51-53]，另外也有采用熒光染色法的，也可以將細菌素直接轉移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，特異性抗體和免疫組織化學法也被證明是可行的，目前它僅作為一種補充檢測和定量細菌素的方法[15]。

5 展望

細菌素的作用機制特殊，致病菌不會對其產生耐藥性，也不會像抗生素一樣產生耐藥株，由于其本質是多肽，在人體內會被蛋白酶消化，因而不會改變人體腸道正常菌群的存活，已經成為現階段乃至今后很長一段時間微生物天然防腐劑的研究熱點。目前，對細菌素的研究依然側重于開發新的抑菌譜廣、抑菌效果好的廣譜細菌素，細菌素的分離純化是研究的重點，確定細菌素的氨基酸序列和組成、編碼基因的定位、代謝調控機理以及在食品儲存和保鮮中的開發利用將會成為未來細菌素的熱點研究方向。

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