Loxp序列位置對基因表達的影響

許盈盈，靳偉，代敏敏，樊寶良

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Loxp序列位置對基因表達的影響

許盈盈，靳偉，代敏敏，樊寶良

（河北農業大學動物科技學院 河北保定 071001）

【目的】先選用綠色熒光蛋白基因（）作為試驗基因構建loxp位點位于egfp基因上游或下游不同位置的表達結構，對loxp位點的位置對基因表達的影響進行初步分析。然后以植酸酶（）基因為另一個試驗基因對通過egfp基因得出的結果進行進一步驗證。研究結果為開展通過基因打靶技術將外源基因與內源基因通過2A序列連接共表達的轉基因動物制作中，打靶位點的選擇提供可靠依據。【方法】先選擇增強綠色熒光蛋白基因（）為試驗基因,紅色熒光蛋白基因（為內參基因。以pEGFP-N2、pGEM-5zf-loxp質粒為基礎，構建了ploxp-EGFP（loxp序列位于egfp基因開放閱讀框的Kozak序列上游的5′非翻譯區）、pEGFP-loxp（loxp序列位于egfp基因開放閱讀框的終止密碼子下游的3′非翻譯區）、ploxp-EGFP-loxp（egfp基因開放閱讀框的Kozak序列上游5′非翻譯區和終止密碼子下游3′非翻譯區各有一個loxp序列）。以pEGFP-N2質粒為對照質粒，以pDsRed2-N1為內參質粒，與所構建的egfp基因各表達質粒共轉染PK15細胞，轉染24h后在熒光顯微鏡下觀察熒光表達情況，用熒光分析軟件Image J進行熒光強度分析并記錄熒光強度，進而應用SPSS19.0軟件對各轉染熒光表達情況進行分析，確定loxp序列的位置對基因表達的影響。為了對以egfp基因為試驗基因所得到的結果進行進一步驗證，本試驗選擇植酸酶（phytase基因）基因為試驗基因，egfp基因為轉染內參基因螢火蟲熒光素酶基因（luciferase基因）為表達內參基因。以pIREsNEo、pGEM-5zf-loxp和pT-phytase、pGL4.13[luc2/SV40]質粒為基礎。構建了p-SV40-luciferase-CMV-loxp-phytase（loxp序列位于phytase基因開放閱讀框的Kozak序列上游的5′非翻譯區）、p-SV40-luciferase-CMV-loxp-phytase-loxp（phytase基因開放閱讀框的Kozak序列上游5′非翻譯區和終止密碼子下游3′非翻譯區各有一個loxp序列）、p-SV40-luciferase-CMV-phytase-loxp（loxp序列位于phytase基因開放閱讀框的終止密碼子下游的3′非翻譯區）和p-SV40-luciferase-CMV-phytase（phytase基因開放閱讀框的上下游均無loxp序列）等試驗質粒,以egfp基因(pEGFP-N2)為轉染內參基因與所構建的各種phytase基因表達結構共轉染PK15細胞，同時設置一個轉pEGFP-N2+ pDsRed2-N1的空白對照。轉染48h后在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白基因表達情況，用熒光分析軟件Image J進行熒光強度分析并記錄熒光強度，應用SPSS19.0軟件對各轉染綠色熒光表達情況進行分析。同時應用鉬藍法測定各轉染的植酸酶活性。應用螢火蟲螢光素酶報告基因檢測試劑盒檢測各轉染螢火蟲熒光素酶活性。用SPSS19.0軟件對各轉染的植酸酶和螢火蟲熒光素酶表達水平（活性）進行統計分析。【結果】試驗中以為內參基因，對轉染后每個轉染的不同區域紅色熒光強度平均值(代表各轉染紅色熒光蛋白的表達水平)進行統計分析表明egfp基因各結構每個轉染的間紅色熒光蛋白表達水平差異不顯著，表明不同轉染間排除了轉染操作、質粒純度、細胞活性等的差異對分析結果的影響，轉染前質粒的電泳結果表明，各質粒間不同構象的質粒比例基本一致，這也基本排除了轉染用質粒質量的差異對轉染效果的影響，對各轉染不同區域綠色熒光強度的平均值（代表各轉染的egfp基因表達水平）進行的統計分析表明，同一結構不同轉染間egfp基因表達水平差異不顯著，不同結構的轉染間存在差異，其中ploxp-EGFP和ploxp-EGFP-loxp結構轉染中綠色熒光蛋白的表達水平顯著低于pEGFP-loxp和pEGFP-N2，而pEGFP-loxp和pEGFP-N2轉染間基因間的表達差異不顯著。這一結果初步說明loxp序列在外源基因開放閱讀框下游時對基因表達水平沒有影響，在外源基因開放閱讀框上游時對基因表達呈負影響，為了進一步驗證上述結果的可靠性，本研究以植酸酶基因作為另一試驗基因，以螢火蟲熒光素酶基因為表達內參基因，以egfp基因為轉染內參基因再次進行了驗證，驗證試驗得到了相似的結果。【結論】開展通過基因打靶技術將外源基因與內源基因通過2A序列連接，實現外源基因和內源基因共表達的轉基因動物制作研究中，以Cre/loxp系統作為報告基因刪除工具時，則內源基因的下游為最佳的打靶位點。

loxp序列； 基因表達； 2A序列； 基因打靶

0 引言

【研究意義】轉基因動物技術是一種行之有效的快速動物育種新技術，可用于高附加值[1-2]、環境友好[3]、生產性能[4]或產品品質改良[5]以及抗病[6]等的動物新品種培育。目前轉基因動物制作所獲得的轉基因動物，外源基因多以多拷貝串聯方式隨機整合到受體動物基因組中。這就使得目前轉基因動物制備中存在導致內源基因表達異常[7]、外源基因異位表達[8-9]、外源基因表達及遺傳穩定性差[10]且外源基因的表達水平缺乏可預見性和可控性[11]等問題。這些因素一直制約著轉基因動物的研究與應用，探討解決上述問題的有效方法是推動轉基因動物技術進步并有效服務于人類的重要前提。基因打靶技術[12]能夠將外源基因精確的插入到受體基因組中的特定位點。探討通過基因打靶技術將外源基因定點插入到內源基因的開放閱讀框的上游或者下游，通過融合肽2A序列[13]連接，使外源基因與內源基因融合表達，是解決上述問題的思路之一。早期的基因打靶技術因為效率低下[14]，無法實現上述目標。對基因打靶機理的研究表明，在特定位點高效實現DNA雙鏈斷裂能大大提高了基因打靶的效率[15]。近年來一些人工核酸酶技術如：鋅指核酸酶[16-17]、類轉錄激活因子效應物核酸酶[18-19]，和CRISPR/Cas 系統[20-21]等的出現。使得人們可以在基因組的任意位點高效產生DNA雙鏈斷裂而使得基因打靶效率得到了顯著提高[22]，這使得上述思路的實現成為可能。然而這些新的技術的出現與應用雖然使得基因打靶效率獲得了顯著提高但仍然較低。在大多數情況下利用這些技術進行基因打靶仍然需要使用報告基因來有效富集陽性克隆以提高篩選效率[23-24]。而從生物安全角度考慮在獲得了同源重組的轉基因細胞后需要將報告基因表達結構刪除。Cre/Loxp系統是目前應用較為廣泛的報告基因刪除系統[25-27]。【前人研究進展】Cre/loxp系統是1981年人們從P1噬菌體及其宿主細胞中發現的重組酶系統[28]。loxp序列是由34個堿基對構成的一個反向重復序列。Cre酶能夠對該序列進行識別和加工。如果在一段序列的兩側各有一個loxp序列且方向相同，則在Cre酶作用下位于兩個loxp序列之間的DNA就會被從原來的DNA分子中切下，也就是刪除。人們應用這一原理建立了基于Cre/loxp的刪除系統，并應用于報告基因的刪除以及在基因功能研究中用于條件敲除內源基因，來闡明該基因在特定組織細胞類型或特定發育時期的功能[29-30]。Cre/loxp系統用于報告基因或作為條件敲除內源基因時loxp序列都是位于報告基因或欲敲除基因完整表達結構的兩側，已有的研究表明這種結構對報告基因或欲敲除的內源基因的表達沒有影響。【本研究切入點】而上述希望通過基因打靶技術將外源基因與內源基因通過2A序列鏈接實現共表達的設想中會將loxp序列留置于基因開放閱讀框的上游或下游的非翻譯區中。而loxp序列已如前述是一種反向重復序列，其出現在基因開放閱讀框的上游或下游的非翻譯區中時，將在轉錄產生的mRNA上游或下游非翻譯區中形成發卡型二級結構，而這種二級結構的形成有可能對mRNA的翻譯效率產生影響，而且loxp位點的位置不同可能影響程度有所不同，闡明這一效應對開展上述思路的研究中打靶位點的選擇具有重要意義，而目前還缺乏這方面的相關研究報道。【擬解決的關鍵問題】以增強的綠色熒光蛋白（egfp）基因為試驗基因，探究loxp序列在egfp基因開放閱讀框的上游或下游的非翻譯區序列中對基因表達的影響，并進一步以植酸酶基因為試驗基因對以egfp基因為試驗基因得到的結果進行進一步驗證，為上述思路的研究中打靶位點的選擇提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系、菌株、載體 豬腎細胞系PK15（ATCC，美國）；大腸桿菌（）DH5α（TaKaRa, 中國大連）；質粒pEGFP-N2（Clonth，美國）、pIREsNeo（Clonth，美國）、pGL4.13[luc2/SV40]（Promaga, 美國）、pGEM-5zf-loxp（河北農業大學動物科技學院實驗室構建）和pDsRed2-N1（TaKaRa, 中國大連）等由河北農業大學動物科技學院實驗室保存。

1.1.2 試劑 無內毒質粒DNA提取試劑盒QIAGEN Plasmid Mini Kit購自QIAGEN（德國）；限制性內切酶、DNA 分子量標準1kb ladder marker、DNA連接酶等購自Fermentas（美國）；LipofectamineTM2000脂質體轉染試劑購自Invitrogen（美國）；胎牛血清、DMEM、0.25%胰酶購自GIBCO（美國）；無水乙酸鈉、植酸鈉購自Sigma公司（德國），其他試劑均為國產，螢火蟲螢光素酶報告基因檢測試劑盒購自碧云天生物技術公司（中國）；DNA測序工作由上海生工生物工程有限公司完成。

1.2 試驗方法

1.2.1 ploxp-EGFP、pEGFP-loxp、ploxp-EGFP--loxp質粒的構建 試驗于2017年3月于河北農業大學動物遺傳育種與繁殖實驗室進行。以pEGFP-N2、pGEM-5zf-loxp質粒為骨架質粒，通過一系列酶切連接反應構建所需質粒。這些質粒的結構見圖1。

1.2.2 pSV40-luciferase-CMV-loxp-phytase、pSV40- luciferase-CMV-loxp-phytase-lox、p-SV40- luciferase-CMV-phytase-loxp和pSV40-luciferase- CMV-phytase質粒的構建 試驗于2018年1月于河北農業大學動物遺傳育種與繁殖實驗室進行。以pIREsNeo、pGEM-5zf-loxp、pT-phytase、pGL4.13[luc2/ SV40]為基礎通過一系列酶切連接反應構建了這些質粒。這些質粒的結構見圖2。

1.2.3 轉染用質粒DNA提取 各質粒DNA提取按QIAGEN Plasmid Mini Kit 質粒提取試劑盒說明書進行，所提取質粒電泳結果見圖3.

1.2.4 細胞培養與轉染 豬腎細胞系PK15在37℃，5% CO2條件下和含10%新生牛血清的DMEM培養基中常規方法進行培養和傳代。

試驗基因1 （egfp基因）相關結構轉染試驗：試驗于2017年4月于河北農業大學動物遺傳育種與繁殖實驗室進行。在轉染前24 h接種1×105個/ml指數生長期的細胞于24孔板中。培養24 h后細胞匯合度達90%時進行脂質體轉染。每孔轉染質粒800 ng，其中包括對照質粒pEGFP-N2或每種構建的試驗質粒（plxop-EGFP、pEGFP-loxp、ploxp-EGFP-loxp）400 ng和pDsRed2-N1內參質粒400 ng，每組轉染設置3個重復，轉染24 h后將各轉染組置于倒置顯微鏡下觀察各孔內參基因和試驗基因1表達情況。

試驗基因2 phytase基因相關轉染試驗：試驗于2018年3月于河北農業大學動物遺傳育種與繁殖試驗室進行。在轉染前24 h接種1×105個/mL指數生長期的細胞于24孔板中。培養24 h后細胞匯合度達90%時進行脂質體轉染。每孔轉染質粒800 ng，其中每種構建的試驗質粒（pSV40-luciferase-CMV-loxp-phytase、pSV40- luciferase-CMV-loxp-phytase-lox、p-SV40-luciferase-CMV-phytase-loxp和pSV40-luciferase-CMV- phytase）各400 ng和pEGFP-N2內參質粒400 ng，另以400 ng pDsRed2- N1+400 ng pEGFP-N2的共轉染細胞為酶活性空白對照，每組轉染設置3個重復，轉染48 h后將各轉染組置于倒置顯微鏡下觀察各孔轉染內參egfp基因表達情況，并制備酶粗體液做酶活性測定。

1.2.5 試驗基因1egfp基因轉染結果檢測與分析 試驗于2017年4月于河北農業大學動物遺傳育種與繁殖實驗室進行。

A為ploxp-EGFP（loxp序列位于egfp基因開放閱讀框中kozak上游的5′非翻譯區）；B為pEGFP-loxp（loxp序列位于egfp基因開放閱讀框終止密碼子下游3′非翻譯區）；C為ploxp-EGFP—loxp（egfp基因開放閱讀框的Kozak序列上游5′非翻譯區和終止密碼子下游3′非翻譯區各有一個loxp序列）

A為pSV40-luciferase-CMV-loxp-phytase（loxp序列位于phytase基因開放閱讀框中kozak上游的5′非翻譯區）；B為p-SV40-luciferase-CMV-phytase-loxp（loxp序列位于phytase基因開放閱讀框終止密碼子下游3′非翻譯區）；C為pSV40-luciferase-CMV-loxp-phytase-lox（phytase基因開放閱讀框的Kozak序列上游5′非翻譯區和終止密碼子下游3′非翻譯區各有一個loxp序列）；D為pSV40-luciferase-CMV-phytase（phytase基因上下游非翻譯區序列中均添加loxp序列）

1.2.5.1 熒光顯微鏡觀察熒光蛋白基因表達情況 轉染細胞前在細胞培養板上用記號筆對每個孔進行劃線均分為6個區域，轉染24 h后在熒光顯微鏡下觀察并記錄所分區域，對各區域egfp與dsred2基因表達情況以及明視野中細胞照相并用Image J軟件分析光密度值。整理數據，進行統計學分析。

1.2.5.2 結果的統計與分析 提取每孔中不同區域的紅色熒光和綠色熒光的光密度值后，依據所得數據應用SPSS 19.0 統計軟件進行一維方差分析，分析方法采用Tukey法，對每轉染組的三個重復間以及不同轉染組間的兩種熒光強度的差異顯著性進行分析，來確認loxp序列的位置對外源基因表達的影響。

1.2.6 試驗基因2（phytase基因）轉染結果檢測與分析本試驗于2018年3月于河北農業大學動物遺傳育種與繁殖實驗室進行。

1.2.6.1 熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白基因表達情況 轉染細胞前在細胞培養板上用記號筆對每個孔進行劃線均分為6個區域，轉染48 h后在熒光顯微鏡下觀察并記錄所分區域，對各區域egfp基因表達情況以及明視野中細胞照相并用Image J軟件分析光密度值。整理數據，進行統計學分析。

提取每孔中不同區域的綠色熒光光密度值后，依據所得數據應用SPSS 19.0 統計軟件進行一維方差分析，分析方法采用Tukey法，對每轉染組的三個重復間以及不同轉染組間的綠色熒光強度的差異顯著性進行分析，來確定各轉染間是否存在因轉染質粒純度、細胞活性以及轉染操作帶來的誤差。

1.2.6.2 表達內參基因和試驗基因2（phytase基因）表達情況水平分析 轉染48 h后，將細胞版中的待測細胞用PBS（pH7.3）洗一次，去除殘余液體，加入細胞裂解液200 μL，室溫裂解20 min，將細胞裂解物移至1.5 mL離心管中，12 000 r/min 4℃離心5 min去除細胞碎片，稱為酶粗提液，然后用酶粗提液測定熒光素酶和植酸酶的活性。

熒光素酶活性測定：參考試劑盒說明書進行，大致過程為：取20 μL酶粗提液，加入底物100 μL，使用LKB公司的化學發光儀Wallac 1250 Luminoneter，輸出值為毫伏（mV），測定10秒的發光強度（代表試樣的熒光素酶活性）。

植酸酶基因活性測定：采用鉬酸顯色法進行測定，主要參照程海娜等[31-32]方法進行。顏色/終點混合液：250 mL鉬酸銨（100 g·L-1）+ 250 mL釩酸銨（2.35 g·L-1）+ 165 mL 65%硝酸+335 mL水。取100 μL酶粗提液加入100 μL 1. 25 mol·L-1乙酸緩沖液（pH 5. 5）進行稀釋，同時設置一個空白對照，即200 μL 1. 25 mol·L-1乙酸緩沖液（pH 5.5）替代酶粗提液稀釋液，與其他試樣同時進入后續步驟。向稀釋的酶粗提液和對照樣中加入0.6 mL 1.25 mol·L-1乙酸緩沖液（pH 5.5），混勻，在37℃保溫5 min，然后加入1.6 mL的8.4 g·L-1植酸鈉，繼續保溫30 min，加入顏色/終點混合液1.6 mL，以空白對照校正，采用分光光度計在415 nm波長下測定吸光值，記錄每試樣的吸光值（代表試樣植酸酶活性）。

2 結果

2.1 轉染用質粒DNA提取

圖3顯示所提取的轉染用質粒質量一致性很好，質粒質量引起的各轉染間產生的差異基本可以忽略。

A 為試驗基因1（egfp基因）系列質粒電泳結果M為1kb ladder 分子量標準；1為pEGFP-N2質粒；2為ploxp-EGFP質粒, 3為ploxp-EGFP-loxp質粒，4為pEGFP-loxp質粒, 5為pDsRed2-N1質粒；B為試驗基因2（phytase基因）系列質粒電泳結果，其中M為1kb ladder 分子量標準，1為pEGFP-N2質粒, 2為pSV40-luciferase-CMV-loxp-phytase質粒, 3為pSV40-luciferase-CMV-loxp-phytase-loxp質粒，4為pSV40-luciferase-CMV- phytase-loxp質粒, 5為pSV40-luciferase-CMV-phytase質粒

2.2 試驗基因1（egfp基因）試驗

2.2.1 定性分析 圖4為對照質粒及不同結構的試驗基因1質粒與內參質粒共轉染后綠色熒光蛋白和紅色熒光蛋白基因表達情況。結果顯示，不同轉染組中紅色熒光蛋白表達基本一致，表明各不同轉染組間因細胞活性、轉染質粒純度及轉染操作產生的誤差不顯著，在此情況下，不同loxp位置的質粒的綠色熒光蛋白表達情況不完全一致，pEGFP-loxp與pEGFP-N2轉染組的綠色熒光蛋白表達強度基本一致，ploxp- EGFP、ploxp-EGFP-loxp轉染組綠色熒光蛋白表達要比pEGFP-N2轉染組綠色熒光蛋白表達強度明顯低，這一結果表明，loxp序列在基因開放閱讀框的下游對基因表達基本無影響，而loxp序列在基因開放閱讀框上游時對基因表達呈顯著負影響。

2.2.2 egfp基因轉染結果分析 圖4結果只是對轉染結果的定性分析，為了得到更為確切的結論，本研究應用Image J軟件對所拍照片的熒光強度進行了提取，得到了每個區域的兩種熒光的光密度值（表1）。

依據表1中的數據應用SPSS 19.0 統計軟件進一步對每組轉染三個重復間及不同轉染組間綠色熒光蛋白和紅色熒光蛋白表達的差異顯著性進行分析（表2）。

由表2可看出，轉染孔中紅色熒光蛋白平均光密度值組內與組間均差異不顯著，排除了轉染過程中試驗操作誤差或不同質粒純度以及細胞活性差異等對試驗結果造成的影響。而轉染構建質粒表達的綠色熒光蛋白平均光密度值在4個轉染組中不完全相同，轉染pEGFP- loxp與pEGFP-N2質粒中綠色熒光蛋白平均光密度值差異不顯著（＜0.05，＜0.01），轉染ploxp-EGFP、ploxp-EGFP-loxp質粒中綠色熒光蛋白平均光密度值與轉染pEGFP-N2質粒中綠色熒光蛋白平均光密度值有極顯著差異（＞0.01），表明在轉染條件一致的情況下，loxp序列在基因下游位置對基因表達影響不顯著，loxp序列在基因上游對基因表達影響極顯著，且為負影響。

A.為對照質粒pEGFP-N2與內參質粒pDsRed2-N1共轉染；B為試驗質粒ploxp-EGFP與內參質粒pDsRed2-N1共轉染；C為試驗質粒pEGFP-loxp與內參質粒pDsRed2-N1共轉染；D為試驗質粒ploxp-EGFP-loxp與內參質粒pDsRed2-N1質粒共轉染

2.3 試驗基因2（phytase基因）轉染分析

2.3.1 轉染內參基因表達分析 從圖5的定性分析結果顯示各轉染間轉染內參egfp基因表達水平差異并不明顯，初步顯示質粒純度、細胞活性以及轉染操作等誤差對試驗結果沒有顯著影響。

依據表3中的數據應用SPSS 19.0 統計軟件進一步對每組轉染三個重復間及不同轉染組間綠色熒光蛋白表達的差異顯著性進行分析（表4）。表3和表4的分析表明不同轉染間綠色熒光蛋白表達水平差異不顯著，從這一分析結果可以認為各轉染間由于質粒的純度、細胞活性差異以及轉染操作帶來的誤差很小，不影響最終得出結論的準確性。

2.3.2 表達內參基因和試驗基因表達分析

2.3.2.1 表達內參基因表達測定結果從表5的分析可以看出，除了空白對照組（pDsRed2-N1+ pEGFP-N2）外其他各轉染的不同轉染間熒光素酶的活性差異不顯著（＞0.05），而空白對照的三個重復間差異也不顯著（＞0.05），這一結果進一步說明各轉染間因質粒質量、細胞活性以及和轉染誤差以及酶活測定中的操作誤差造成的差異很小可以忽略。

A.為表達對照質粒pSV40-luciferase-CMV -phytase與轉染內參質粒pEGFP-N2共轉染結果；B為試驗質粒pSV40-luciferase-CMV-loxp-phytase與內參質粒pEGFP-N2共轉染結果；C為試驗質粒pSV40-luciferase-CMV -phytase-loxp與內參質粒pEGFP-N2共轉染結果；D為試驗質粒pSV40-luciferase-CMV-loxp-phytase-loxp與內參質粒pEGFP-N2質粒共轉染結果；E為pDsRed2-N1與pEGFP-N2共轉染作為試驗基因phytase和表達內參基因luciferase的陰性對照

表1 不同轉染三個重復試驗的不同區域的兩種熒光光密度值

Re：內參質粒pDsRed2-N1;RP：紅色熒光平均光密度值；GP：綠色熒光平均光密度值；1.1-1.6：每組轉染的第一個平行的6個區域，2.1-2.6：每組轉染的第二個平行的6個區域，3.1-3.6：每組轉染的第三個平行的6個區域

Re: The internal reference plasmid pDsRed2-N1: RP: the average density of red fluorescent; GP: the average density of green fluorescent; 1.1-1.6: the 6 regions of the first parallel; 2.1-2.6: the 6 regions of the second parallel; 3.1-3.6 : the 6 regions of the third parallel

表2 熒光蛋白平均光密度值差異顯著性分析

GP：綠色熒光平均光密度值；RP：紅色熒光平均光密度值。同列數字標不同小寫字母表示差異顯著（＜0.05），不同大寫字母表示差異極顯著（＜0.01）；Re:內參質粒pDsRed2-N1

GP: The average density of green fluorescent；RP: The average density of red fluorescent. Different superscripts lowercase letters within column indicate significant difference (＜0.05), different capital letters within column indicate extremely significant difference(＜0.01); Re: Reference plasmid pDsRed2-N1

表3 不同轉染三個重復試驗的不同區域的綠色熒光光密度值

A：pSV40-luciferase-CMV –phytase+pEGFP；B：pSV40-luciferase-CMV- loxp-phytase+pEGFP；C：pSV40-luciferase-CMV -phytase-loxp+pEGFP- N2；D：pSV40-luciferase-CMV-loxp-phytase-loxp+pEGFP；E：pDsRed2- N1+pEGFP-N2；1.1-1.6：每組轉染的第一個平行的6個區域，2.1-2.6：每組轉染的第二個平行的6個區域，3.1-3.6：每組轉染的第三個平行的6個區域

A: pSV40-luciferase-CMV–phytase+pEGFP：B:pSV40-luciferase-CMV- loxp-phytase+pEGFP; C: pSV40-luciferase-CMV-phytase-loxp+pEGFP- N2; D: pSV40-luciferase-CMV-loxp-phytase-loxp+pEGFP; E: pDsRed2-N1+pEGFP-N2; 1.1-1.6: the 6 regions of the first parallel; 2.1-2.6: the 6 regions of the second parallel; 3.1-3.6: the 6 regions of the third parallel

2.3.2.2 試驗基因1表達測定結果 表6的結果顯示試驗質粒的轉染間植酸酶活性存在差異，試驗質粒pSV40-luciferase-CMV-phytase和試驗質粒pSV40-luciferase-CMV-phytase-loxp之間植酸酶活性差異不顯著，試驗質粒pSV40-luciferase-CMV-loxp -phytase和試驗質粒pSV40-luciferase-CMV-loxp- phytase-loxp之間差異不顯著，而試驗質粒pSV40- luciferase-CMV-phytase、pSV40-luciferase-CMV-phytase- loxp與試驗質粒pSV40-luciferase-CMV-loxp-phytase、pSV40- luciferase-CMV-loxp-phytase-loxp兩兩間差極異顯著（＜0.01），而所有試驗質粒植酸酶活性與空白對照間差異都極顯著（＜0.01）綜合表5和表6的結果進一步證實了試驗基因1（egfp基因）試驗所得出的結論，即loxp序列位于外源基因Kozak序列上游5′非翻譯區時對外源基因表達具有負影響，而只在外源基因的3′端終止密碼子下游時對外源基因的表達無顯著影響。

表4 綠色熒光蛋白平均光密度值差異顯著性分析

表中所列數值為綠色熒光平均光密度值；同列數字標不同小寫字母表示差異顯著（＜0.05），不同大寫字母表示差異極顯著（＜0.01）

The value in the table is the average density of green fluorescent；Different lowercase letters within column indicate significant difference (＜0.05), different capital letters within column indicate extremely significant difference (＜0.01)

表5 不同轉染三個重復試驗的熒光素酶活性（mV）測定及統計分析

A: pSV40-luciferase-CMV –phytase+pEGFP：B:pSV40-luciferase-CMV-loxp-phytase+pEGFP；C: pSV40-luciferase-CMV -phytase-loxp+pEGFP-N2; D: pSV40-luciferase-CMV-loxp-phytase-loxp+pEGFP; E: pDsRed2-N1+pEGFP-N2; 1是每組轉染的第一個重復；2為每個轉染的第二個重復；3為每個轉染的第三個重復。表中所列數值為每一轉染的熒光素酶活性測定值（mV）及統計分析結果；同列數字上標不同小寫字母表示差異顯著（＜0.05），不同大寫字母表示差異極顯著（＜0.01）

A: pSV40-luciferase-CMV –phytase+pEGFP：B:pSV40-luciferase-CMV-loxp-phytase+pEGFP；C: pSV40-luciferase-CMV -phytase-loxp+pEGFP-N2; D: pSV40-luciferase-CMV-loxp-phytase-loxp+pEGFP; E: pDsRed2-N1+ pEGFP-N2；1. The first transfection repeat for every experimental plasmid；2. The second transfection repeat for every experimental plasmid；3. The third transfection repeat for every experimental plasmid. The value in the table is the estimated value of luciferase activity(mV) for every transfection and the statistic analysis result; Different superscripts lowercase letters within column indicate significant difference (＜0.05),different capital letters within column indicate extremely significant difference(＜0.01)

表6 不同轉染三個重復試驗的植酸酶活性（吸光值）測定及統計分析

A: pSV40-luciferase-CMV –phytase +pEGFP：B:pSV40-luciferase-CMV-loxp-phytase+pEGFP；C: pSV40-luciferase-CMV -phytase-loxp+pEGFP-N2; D: pSV40-luciferase-CMV-loxp-phytase-loxp+pEGFP; E: pDsRed2-N1+pEGFP-N2; 1是每組轉染的第一個重復；2為每個轉染的第二個重復；3為每個轉染的第三個重復；表中所列數值為每一轉染的植酸酶活性測定值（吸光值）及統計分析結果；同列數字標不同小寫字母表示差異顯著（＜0.05），不同大寫字母表示差異極顯著（＜0.01）

A: pSV40-luciferase-CMV –phytase+pEGFP：B:pSV40-luciferase-CMV-loxp-phytase+pEGFP；C: pSV40-luciferase-CMV -phytase-loxp+pEGFP-N2; D: pSV40-luciferase-CMV-loxp-phytase-loxp+pEGFP; E: pDsRed2-N1+pEGFP-N2；1. The first transfection repeat for every experimental plasmid；2. The second transfection repeat for every experimental plasmid；3. the third transfection repeat for every experimental plasmid. The value in the table is the estimated value of luciferase activity (mV) for every transfection and the statistic analysis result；Different lowercase letters within column indicate significant difference (＜0.05), different capital letters within columnindicate extremely significant difference (＜0.01)

3 討論

mRNA作為蛋白質合成的模板指導蛋白質的合成。雖然mRNA為單鏈分子，但由于其局部互補配對在生理條件下可互補配對形成二級結構，這種二級結構的形成對mRNA 指導蛋白質的合成效率的影響是多方面的。首先，在mRNA指導蛋白質合成過程中需要打開這些二級結構才能閱讀密碼子進行正常翻譯，因此大量的二級結構的存在勢必會減慢蛋白質合成的速度。尤其是在mRNA的5′非翻譯區大量的RNA二級結構的存在會影響蛋白質合成的起始，5′非翻譯區的二級結構對蛋白質合成效率的影響可能更為強烈[33]。對酵母全基因組水平的研究表明，起始密碼子周圍-40—+40 nt范圍內高含量的二級結構對基因翻譯的確存在一定的抑制作用，同時mRNA 5′非翻譯區及起始密碼子下游40nt的序列中二級結構的存在不利于mRNA出核[34]，而成熟的mRNA出核是其進行蛋白質合成前提條件。這一研究似乎表明mRNA 5′非翻譯區中RNA二級結構的存在對蛋白質具有更多不利的影響，人們對小鼠[35]、斑馬魚[36]和擬南芥[37]的研究也發現了同樣的規律，即多數基因5′非翻譯區二級結構相對含量比較低，這表明這一現象在進化上具有一定的保守性，而mRNA3′非翻譯區在酵母和擬南芥中二級結構含量相對較低，而在小鼠、斑馬魚中卻相對較高這似乎說明mRNA 3′非翻譯區的二級結構含量保守性較低，因此對基因表達效率的影響并不重要。然而對小鼠胚胎干細胞mRNA二級結構的研究[38]，卻發現這種細胞類型中mRNA的5′非翻譯區和3′非翻譯區的二級結構含量都相對較高，這可能與小鼠胚胎干細胞中表達的有些基因5′非翻譯區中某些二級結構有特殊的生物學功能如屏蔽micoRNA作用位點等有關。因此從上述分析中可知在一個基因的5′或（和）3′非翻譯區添加一個反向重復序列其效應需要進行評價。

Cre/loxp刪除系統中loxp序列基本結構為長34 bp，中間是8 bp的核心序列，兩邊是13 bp的反向重復序列。當Cre 重組酶識別loxp 位點后，可以在該位置切斷DNA，并在斷端形成中間體，在Cre 重組酶催化下可重組連接。因此，同一條DNA 分子上若有兩個loxp位點，且方向相同，重組后則loxp位點間的核酸序列被特異性刪除，并在原位點留置一個loxp序列，如果以Cre/loxp系統作為報告基因刪除系統通過基因打靶將外源基因定點整合到內源基因的上游或下游并通過2A序列鏈接形成共表達結構，會在融合表達結構的上游或（和）下游非翻譯區留置一個loxp序列。當基因表達時轉錄產生的mRNA分子中上游或（和）下游會存在一個loxp序列，該序列會形成一個13 bp長的發卡型二級結構，該二級結構對外源基因的影響需要進行評估以便為上述設想的研究中打靶位點的選擇提供依據。

本研究先選擇egfp基因作為試驗基因1，開展了研究結果初步顯示loxp序列位于外源基因上游時對基因表達形成了強烈的抑制作用，而在外源基因下游時對外源基因的表達沒有顯著的影響，為了進一步證實試驗基因1（egfp基因）的結果，筆者選用phytase基因作為試驗基因2進一步驗證試驗基因1的結果，試驗基因2（phytase基因）的結果和試驗基因1（egfp基因）的結果基本一致。據此可以認為loxp序列位于基因上游時對基因表達有強烈的抑制作用，而在外源基因終止密碼子下游時對外源基因的表達沒有顯著的影響。

分析產生這一現象的原因在于Cre/loxp結構是感染大腸桿菌的P1噬菌體的基因和序列，loxp序列在真核生物細胞基因組中并不存在，因此真核細胞中不會有針對loxp序列的相應的調控因子，因此loxp經轉錄出現在成熟mRNA的5′非翻譯區時，不會有類似屏蔽micoRNA結合位點或被其他反式調控因子識別增強蛋白質翻譯的作用，其自身形成的發卡結構會使核糖體的翻譯效率下降甚至提前脫落，而因此其作用只有抑制了核糖體的翻譯起始過程，從而導致外源基因表達下降；而loxp序列在基因開放閱讀框下游的3′非翻譯區內時其序列形成的發卡結構在外源基因終止密碼子之后，即核糖體在翻譯完成后才遇到相應的二級結構，因此該二級結構對蛋白翻譯效率沒有明顯影響。這一結果也和前人對真核生物mRNA二級結構對基因表達的影響的研究結果基本一致。

4 結論

在開展通過基因打靶技術將外源基因與內源基因通過2A序列連接，實現外源基因和內源基因共表達的轉基因動物制作研究中，以Cre/loxp系統作為報告基因刪除工具時，則內源基因的下游為最佳的打靶位點。

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（責任編輯 林鑒非）

Researching on the Effect of the Location of Loxp Sequence on the Gene

XU YingYing, JIN Wei, DAI MinMin, FAN BaoLiang

(College of Animal Sciences, Hebei Agricultural University, Baoding 071001, Hebei)

【Objective】In order to get a solid foundation for the site selection of a gene targeting experiment which aimed to realize the co-expression of the foreign gene and the endogenous gene linked through 2A sequence, the effect on the gene expression of different location of the loxp sequence at the open reading frame of a gene need to be clarified when the Cre/loxp system was selected as a tool for reporter gene deletion. 【Method】The enhanced green fluorescent protein (egfp) gene was selected as experimental gene, and red fluorescent protein (dsred2) gene as internal reference gene. Based on pEGFP-N2, pGEM-5zf-loxp plasmid, three plasmids with different location of loxp sequence at the open reading frame of egfp gene named ploxp-EGFP (The loxp sequence located at the upstream of the Kozak sequence in the 5′un-translation region of egfp gene), pEGFP-loxp (The loxp sequence located at the downstream of the termination codon in the 3′un-translation region of egfp gene) and ploxp-EGFP-loxp (There is one loxp sequence located at the upstream of the Kozak sequence in the 5′un-translation region and another downstream of the termination codon in the 3′un-translation region of egfp gene) were constructed. As the internal reference, Plasmid pDsRed2-N1 was co-transfected with constructed plasmids into PK15 cells. Twenty-four hours later, the fluorescence intensity of every transfection was observed and analyzed using fluorescence microscope and software Image J. In order to verify the result obtained using egfp gene as experimental gene, phytase gene was selected as another experimental gene. Based on pIREsNeo, pGEM-5zf-loxp, pT-phytase, pGL4.13[luc2/SV40] plasmid and luciferase gene as expression internal reference gene four plasmids with different location of loxp sequence at the open reading frame of phytase gene named p-SV40-luciferase-CMV-loxp-phytase (The loxp sequence located at the upstream of the Kozak sequence in the 5′un-translation region of phytase gene, p-SV40-luciferase-CMV-loxp-phytase-loxp (There is one loxp sequence located at the upstream of the Kozak sequence in the 5′un-translation region and another downstream of the termination codon in the 3′un-translation region of phytase gene), p-SV40-luciferase-CMV-phytase-loxp (The loxp sequence located at the downstream of the termination codon in the 3′un-translation region of phytase gene), p-SV40-luciferase-CMV-phytase (There is no loxp sequence located at the upstream of the Kozak sequence in the 5′un-translation region and another downstream of the termination codon in the 3′un-translation region of phytase gene)were constructed. As transfection internal reference, pEGFP-N2 was co-transfection with the differenct plasmid constructed above into PK15 cells, pEGFP-N2 and pDsRed2-N1 were co-transfected into PK15 cells to work as blank control for enzyme activity of phytase and luciferase. Forty-eight hours later, the fluorescence intensity of every transfection was observed and analyzed using fluorescence microscope and software Image J. These data were analyzed using statistics software SPSS19.0. At the same time, the activity of phytase and luciferase of every transfection were measured by Molybdenum Blue Method or using Firefly Luciferase Assay Kit, and these data were analyzed using statistics software SPSS19.0.【Result】In the experiment, thegene worked as internal reference gene. Statistics analysis using the average value of red fluorescence of different area of every transfection as basic data shows there is no significant difference between every different transfection. This result shows there is no significant difference in purity of plasmid, handling and cell activity between every transfection. Plasmid electrophoresis result shows there is no significant difference in quality between every plasmid used in transfections, this means the difference in quality between every plasmid used in every transfection is not enough to influence the accuracy for analysis. Analysis on the green fluorescence in the same rule shows there is no significant difference between different transfection of the same plasmid and between pEGFP-N2 and pEGFP-loxp, ploxp-EGFP and ploxp-EGFP-loxp, but there is significant difference between pEGFP-N2, pEGFP-loxp and ploxp-EGFP ploxp-EGFP-loxp. These result shows loxp sequence had no effect on egfp gene expression when it is located downstream of the open reading frame of the gene, but had a negative effect on egfp gene expression when it located upstream of the open reading frame of the gene. Replacing the egfp gene bygene and using egfp gene as transfection internal reference gene, luciferase gene as expression internal reference gene, it shows a same result.【Conclusion】These results indicate that if we try to prepare a transgenic animals in which the foreign gene and the endogenous gene is linked by 2A sequence and co-express under the regulation of the full regulation element of the endogenous gene in one copy manner and the Cre/loxp system is selected as a tool for reporter gene deletion, the downstream of the open reading frame of the endogenous gene is the suitable targeting site.

loxp sequence; gene expression; 2A sequence; gene targeting

2017-10-09；

2018-05-04

轉基因重大專項（2014ZX08006-005）、國家自然科學基金（30972081）、河北省現代農業產業技術體系蛋肉雞產業創新團隊遺傳資源開發與利用崗位項目（HBCT2018150201）、河北省科技支撐計劃項目（14236602D-4（2014））

許盈盈，E-mail：289637781@qq.com。

樊寶良，Tel：13513125768；E-mail：fanbl119@vip.sina.com

10.3864/j.issn.0578-1752.2018.13.013