七葉皂苷鈉通過上調SOCS-1表達抑制腦內出血誘發的炎癥反應

范永會，王星利，張永麗，柴藝文

0 引言

腦出血(Intracerebral hemorrhage，ICH)指非外傷造成的腦實質內出血，屬于急性腦血管疾病的危重癥，具有較高的發病率和致殘率，對人類生命健康造成嚴重危害[1]。腦內出血發病機制極其復雜，至今尚未完全闡明，且無特異性治療藥物[2]。近年研究表明，腦出血后伴發腦水腫是造成患者死亡率高的主要原因，而腦水腫的形成與炎癥反應具有密切聯系[3]。細胞因子信號傳導抑制因子1(Suppressors of cytokine signaling-1,SOCS-1)是由細胞產生的細胞信號傳導負性調節蛋白，最新研究發現，其是先天性免疫及獲得性免疫的關鍵調節因子，參與自身免疫疾病、炎癥疾病等多種疾病的發生發展[4]。七葉皂苷鈉具有消炎、消腫脹、恢復血管通透性等藥理活性，臨床研究表明，其在腦出血治療中亦具有明顯效果[5]。因此，本研究通過七葉皂苷鈉給藥，觀察其對腦出血大鼠血腫周圍腦組織SOCS-1的表達及相關炎癥因子的影響，以期闡明其治療腦出血的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 取2月齡雄性SD大鼠40只，SPF級，體重(280±20)g，購自河南省動物實驗中心，合格證號：SCXK(豫) 2013-0001。

1.2 實驗藥物與試劑 七葉皂苷鈉注射液：購自武漢普生制藥有限公司，規格：5 mg/支，批號：國藥準字H20057826。TNF-α、IL-1β、IL-6雙抗體夾心法酶聯免疫實驗(ELISA)檢測試劑盒，購自南京建成生物工程研究所；TRIZOL購自美國Invitrogen公司；逆轉錄試劑盒和SYBR?Premix Ex Taq?熒光定量檢測試劑盒，購自日本Takara公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成；RIPA蛋白裂解液和BCA試劑盒購自北京康為世紀生物技術有限公司；PVDF膜購自美國Millipore公司；兔抗鼠SOCS-1、NF-κB抗體、羊抗兔IgG二抗，購自美國Abcam公司；ECL化學發光顯色試劑盒，購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.3 實驗儀器 鼠腦定位儀，購自深圳市瑞沃德生命科技有限公司；分析天平，購自德國Sartorius公司；冷凍離心機，購自美國Beckman公司；全波長酶標儀，購自美國Thermo公司；Mastercycler PCR儀，購自德國Eppendorf公司；7500型熒光定量PCR儀，購自美國ABI公司；電泳儀、轉膜儀，購自北京六一儀器公司；全自動凝膠成像分析系統，購自美國Bio-Rad公司。

1.4 動物分組及造模 將48只SD大鼠隨機分為假手術組、模型組、七葉皂苷鈉(低、中、高劑量)組，共5組，每組8只。參照Rosenberg等[5]自體血注射法建立模型。10%水合氯醛以350 mg/kg腹腔注射，固定大鼠于立體定位儀，顱頂消毒，正中線切開皮膚約1.5 cm，暴露前囟。自體血采集：置大鼠尾端于溫水7 min，酒精消毒，于尾端2 mm外斷尾采集血液。參照大鼠腦立體定位圖譜定位，前囟前0.2 mm、矢狀縫右側3.5 mm、深度5 mm處，微量注射器緩慢注射50 μl新鮮自體血液，6 min注完，留針5 min再緩慢拔出，骨蠟封閉，縫合頭皮。假手術組僅在同一時間點插入微量注射器，注射相同體積的生理鹽水。

1.5 給藥 術后，將大鼠置于安靜、溫暖飼養環境中，各組大鼠于造模后6 h開始給藥。給藥方法：七葉皂苷鈉低劑量組、中劑量組、高劑量組分別腹腔注射2.5、5.0、10.0 mg/(kg·d)的七葉皂苷鈉(溶于2 ml生理鹽水中)；假手術組及模型組給予同體積生理鹽水腹腔注射；高劑量聯合SOCS-1腺病毒干預組在造模后6 h腹腔注射10.0 mg/(kg·d)七葉皂苷鈉的基礎上，采用微量注射器向右側腦室注入含有SOCS-1基因的腺病毒10 μl，注射后留針5 min再緩慢拔出，骨蠟封閉，縫合頭皮，每天1次，給藥5 d。

1.6 觀察指標 ①神經功能行為學評分[6]：采用Longa評分法對大鼠麻醉蘇醒后6 h、1 d、3 d、5 d進行神經行為評分。0分：無神經功能缺損癥狀；1分：大鼠倒懸時，前肢呈屈曲狀態，不能伸展前爪；2分：行走困難，有側旋轉征象；3分：行走困難并向病灶對側傾倒；4分：意識下降，難以行走。②腦組織含水量測量：給藥5 d后，將各組大鼠斷頭處死，采集大鼠腦組織稱重即為濕重，置于80 ℃烘箱中24 h烘干后稱重即為干重，組織含水量=(濕重-干重)/濕重×100%。③ELISA法檢測血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平：給藥5 d后，腹腔注射10%水合氯醛(3.5 ml/kg)進行麻醉后，在近心端抽取股靜脈血2 ml，室溫靜置10 min，3 000 r/min離心10 min，取上清進行分裝后存放于-80 ℃冰箱中；采用ELISA法檢測各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平，具體操作嚴格按照試劑盒說明書進行。④RT-PCR法檢測腦組織SOCS-1、NF-κB mRNA水平：大鼠麻醉取血后，斷頭取腦，并迅速剪取出血灶周圍腦組織，稱重后，迅速加入液氮進行研磨，采用Trizol法提取總RNA，采用逆轉錄試劑盒將總RNA逆轉錄為cDNA，采用RT-PCR法檢測腦組織SOCS-1、NF-κB mRNA表達量。最終結果以β-actin作為內參，采用2ΔΔCt法計算SOCS-1、NF-κB mRNA相對表達量，每組重復3次。引物序列見表1。⑤Western blot法檢測腦組織SOCS-1、NF-κB蛋白水平：樣本采集方法同上，稱重后剪碎，加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解，提取總蛋白。采用BCA檢測試劑盒檢測蛋白濃度，調整濃度一致后，上樣20 μl通過10%SDS-PAGE分離膠分離蛋白，采用電轉法將蛋白轉至PVDF膜上，5%的脫脂乳室溫封閉1 h，吸棄封閉液，加入預先稀釋好的一抗，4 ℃孵育過夜，采用TBST洗滌膜，5 min×3次，加入羊抗兔IgG二抗，室溫孵育2 h，TBST洗滌膜，5 min×3次，進行ECL顯色，采用全自動凝膠成像系統采集圖片，并通過Image-J軟件進行條帶灰度分析，最終結果以目的蛋白與內參蛋白β-actin的光密度比值表示目的蛋白的相對表達水平。

表1 基因的引物序列及產物大小

2 結果

2.1 各組大鼠神經功能行為學評分比較 造模6 h后，假手術組大鼠未見明顯神經行為變化，其他各組大鼠均出現神經缺損癥狀，說明造模成功；造模1 d后各組大鼠神經缺損最為嚴重，3、5 d時逐漸減輕，七葉皂苷鈉低、中、高劑量組大鼠在造模后1、3、5 d神經行為評分均低于模型組，差異有統計學意義(P<0.05)，且具有劑量依賴性。見表2。

2.2 各組大鼠腦組織含水量比較 給藥5 d后，假手術組、模型組及七葉皂苷鈉低、中、高劑量組大鼠腦組織含水量分別為78.23±0.52、81.36±0.69、80.72±0.57、80.03±0.48、79.26±0.51，組間比較差異有統計學意義(F=38.526，P<0.05)；與假手術組比較，模型組大鼠腦組織含水量明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，七葉皂苷鈉低、中、高劑量組腦組織含水量均明顯降低，且呈一定劑量依賴性，組間比較差異有統計學意義(P<0.05)。

2.3 七葉皂苷鈉對腦出血大鼠腦組織TNF-α、IL-1β、IL-6水平的影響 與假手術組比較，模型組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，七葉皂苷鈉低、中、高劑量組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平均明顯降低，且呈一定劑量依賴性，組間差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

2.4 七葉皂苷鈉對腦出血大鼠腦組織SOCS-1、NF-κB mRNA表達的影響 與假手術組比較，模型組大鼠腦組織SOCS-1和NF-κB mRNA水平均明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，七葉皂苷鈉低、中、高劑量組大鼠腦組織SOCS-1 mRNA水平明顯升高，NF-κB mRNA水平明顯下降，組間比較差異均有統計學意義(P<0.05)，且均呈一定劑量依賴性。見圖1。

表2 各組大鼠神經功能行為評分比較(分)

注：與假手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

表3 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較(ng/ml)

注：與假手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

圖1 各組大鼠腦組織SOCS-1、NF-κB mRNA表達水平

2.5 七葉皂苷鈉對腦出血大鼠SOCS-1、NF-κB蛋白表達的影響 與假手術組比較，模型組大鼠腦組織SOCS-1、NF-κB蛋白表達量明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，七葉皂苷鈉低、中、高劑量組大鼠腦組織SOCS-1蛋白表達量明顯升高，NF-κB蛋白表達量明顯降低，組間比較差異均有統計學意義(P<0.05)，且均呈一定劑量依賴性。見圖2。

圖2 各組大鼠腦組織SOCS-1、NF-κB 蛋白表達水平

2.6 SOCS-1、NF-κB蛋白表達水平相關分析 經Pearson相關性分析，結果顯示，腦出血大鼠腦組織SOCS-1和NF-κB的蛋白表達水平呈負相關(r=-0.704，P<0.05)。見圖3。

3 討論

近年來，流行病學調查結果顯示，腦出血的發病年齡逐漸趨于年輕化，且由于腦出血后多繼發腦組織病理改變，甚至造成腦細胞不可逆損傷，導致其致殘率較高，對患者及家庭均造成較大負擔[7]。腦出血后腦水腫多伴有嚴重的炎癥反應，該炎癥反應是由白細胞、巨噬細胞、紅細胞、補體等參與的炎性介質釋放、炎性細胞遷移、腦組織破壞等過程，腦出血后炎癥細胞聚集于病灶，釋放炎性介質，參與腦出血的病理生理過程[8]。研究表明，腦出血后炎癥因子的上調主要以TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8等為主，TNF-α為促炎性細胞因子，可參與影響血管舒縮、導致炎性細胞自血管至神經組織發生遷移，從而參與調節血腫周圍組織缺血性過程[9]；IL-1β亦為促炎性細胞因子，有研究顯示，其表達上調可破壞血腦屏障，導致出血后損傷加劇[10]；IL-6主要通過調節中性粒細胞來調節腦損傷過程。本研究采用自體血注射法建立模型，結果顯示，造模完成后大鼠均表現出不同程度的神經功能損傷，說明造模成功，進而對血清炎癥因子進行觀察，結果顯示，腦出血大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平明顯升高，表明腦出血所誘發的炎癥反應在腦細胞損傷及疾病進展中可能發揮重要作用。

圖3 腦出血大鼠腦組織SOCS-1和NF-κB蛋白表達水平分布圖

七葉皂苷鈉屬于三萜皂苷鈉鹽，由婆羅子干燥成熟果實提取獲得，可通過抑制毛細血管通透性減輕水腫，同時還廣泛參與抗炎、抗腫瘤、改善血液循環、抗滲出等過程。Zhang等[11]在針對糖尿病大鼠創面愈合研究中發現，七葉皂苷鈉可通過抗炎和抗氧化作用有效控制和改善糖尿病大鼠的創面愈合；楊寧等[12]研究表明，七葉皂苷鈉能夠明顯抑制高血壓腦出血患者的炎癥反應，改善腦水腫。本研究給予腦出血大鼠腹腔連續5 d給藥后，同樣觀察到大鼠神經功能有所改善，血清炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6均明顯降低，與已報道觀點一致，且呈現明顯劑量依賴效應，說明七葉皂苷鈉對腦出血誘發的炎癥反應具有抑制作用。

NF-κB是廣泛存在于真核細胞中的核轉錄因子，在機體炎癥反應、細胞凋亡等基因轉錄調控中起核心作用，研究表明其能夠作用于炎癥機制、趨化因子、TNF-α、黏附分子等基因，進而調控其轉錄翻譯[13]。近年來大量證據表明NF-κB與腦出血后繼發腦損傷具有密切聯系，其能夠促進IL-1β、IL-6等炎癥因子表達，進而加劇炎癥反應，加重腦水腫[14]。

SOCS-1是細胞因子信號傳導的負調控因子，能夠反饋阻斷細胞信號傳導，在白血病、銀屑病、惡性腫瘤等多種疾病中發揮重要作用，多項研究發現其能夠在某種程度上阻滯疾病進展，因此被認為是疾病靶向治療的候選基因[15-16]。最新研究發現，在腦出血大鼠模型中miR-155能夠通過下調SOCS-1的表達，促進特異信號轉導，增加TNF-α、IL-1β的轉錄，在腦出血誘導的炎癥中發揮重要作用[17]。Smith等[18]研究指出，SOCS-1不僅是JAK-STAT信號通路的負反饋調節因子，亦是NF-κB、TLR等信號通路的負反饋調節因子。本研究結果顯示，與假手術組比較，模型組大鼠水腫灶周圍腦組織的SOCS-1、NF-κB mRNA及蛋白水平均出現表達上調現象，可能由于腦出血后腦組織缺血性損傷導致NF-κB介導的炎癥反應加重，而在機體免疫系統調控下SOCS-1同樣出現升高，以發揮抑制作用，但SOCS-1含量雖有所增加，但與炎癥因子釋放量相比，其抑制活性仍處于較低水平，進而使機體免疫調控失衡，致使繼發性腦損傷的發生。本研究顯示，七葉皂苷鈉能夠明顯上調SOCS-1的表達，且隨著SOCS-1表達的增加，NF-κB表達出現明顯下降，兩者在腦組織中的表達呈明顯負相關，與Smith等[18]的觀點一致。

綜上所述，七葉皂苷鈉能夠顯著減輕腦出血后腦水腫，改善腦神經功能，其作用機制可能與上調SOCS-1的表達，進而抑制NF-κB及其相關炎癥TNF-α、IL-1β、IL-6的表達有關，本研究為臨床腦出血的防治提供了新的參考思路。

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