FtsZ蛋白在根瘤菌系統學研究中的應用

沈清清，陳紅惠，劉 芳

（1.文山學院 環境與資源學院，云南 文山 663099;2.文山學院 化學與工程學院，云南 文山 663099）

根瘤菌（rhizobium）廣泛分布于土壤中，屬革蘭氏陰性菌，傳統觀念認為根瘤菌是一類從豆科植物根部入侵并與之共生后形成根瘤，能行使自身固氮功能的細菌[1]。近年來，隨著多基因序列分析與全基因組序列測定等分子技術的發展和多種分類方法的推廣，根瘤菌的分類學研究發生了巨大的變化，例如新的屬種不斷推出、對屬種的命名和劃分產生許多爭議，特別是新的研究報道根瘤菌不僅包含共生固氮細菌，同時也包含了非共生固氮的細菌[2]，這一發現徹底顛覆了人們對根瘤菌傳統觀念上的認識。

目前，根瘤菌主要依據16S rRNA的系統發育學分析來確定其菌種的分類地位，但在16S rRNA全序列分析存在一些缺陷，一方面16S rRNA具有高保守性可能會限制種以下的分類，另一方面由于生物間存在基因水平轉移的現象，僅依賴16S rRNA的分析會使分類體系產生偏差或混亂[3]。因此有必要提出或補充根瘤菌菌種鑒定更為可靠的方法和依據。FtsZ蛋白是一類微管蛋白，與細胞分裂密切相關，幾乎存在于所有的原核和真核生物中，研究發現原核生物與真核生物的FtsZ蛋白在進化上由共同祖先進化而來，具有保守性，適合于細菌系統分類學研究[4]。張斌等[5]將FtsZ 蛋白應用于乳酸菌的系統分類研究中，發現FtsZ 蛋白序列的分辨率高于16S rRNA， 更適用于乳酸菌種間的系統分類研究。

本文從NCBI中調取了根瘤菌6個屬共29個菌種的FtsZ 蛋白，從FtsZ 蛋白的角度對根瘤菌進行系統發育學研究，探討根瘤菌物種之間的進化關系，并與最新的根瘤菌分類情況進行了比較。

1 材料與方法

1.1 數據來源

從美國生物信息中心（National Center for Biotechnology information）的蛋白數據庫調出根瘤菌與其它菌屬FtsZ蛋白的數據，人工對氨基酸序列逐條分析，獲得非冗余完整FtsZ蛋白共32條[6]。

1.2 序列比對

利用程序Custal W將FtsZ蛋白氨基酸序列進行比對，再采用蛋白及核酸分析工具ESpript 3.0 分析序列比對圖，之后對比對圖進行美化與加工。

1.3 系統發育分析

采用生物核酸與蛋白序列比對軟件Clustalx 2.0將32條FtsZ蛋白序列進行比對分析，根據比對結果用 MEGA 7.0 構建NJ 系統進化樹[7]；Bootstrap 分析中使用 1 000 次重復計算 NJ 樹的支持率。采用生物信息學方法分析結果。

2 結果

2.1 數據的選擇

如表1所示，經過篩選和分析，最終從NCBI根瘤菌蛋白數據庫中下載了29個菌種的FtsZ蛋白（序列登錄號見表1）作為研究對象，這29個菌種分別屬于根瘤菌屬（Rhizobium）、慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）、土壤根瘤菌屬（Agrobacterium）、中華慢生根瘤菌屬（Mesorhizobium）、伯克霍爾德菌屬（Burkholderia）和貪銅菌屬（Cupriavidus）；另外還下載了埃希氏菌屬（Escherichia）下3個菌種的FtsZ蛋白作為外群。從表1所列數據可以看出，α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）與β-變形桿菌綱（Betaproteobacteria）相比FtsZ蛋白氨基酸序列長度差異較大，歸屬α-變形菌綱的根瘤菌氨基酸序列長度在546～609區間；而歸屬于β-變形桿菌綱則在393～444區間。

表1 FtsZ蛋白相關信息

續表1：

2.2 FtsZ蛋白序列比對分析

從表1所列的每一屬里選擇模式菌種為代表進行序列比對，獲得比對圖（見圖1），這些進行比對的氨基酸序列長度最小為398aa，最長為601aa，比對寬度為607 Residues。

圖1 氨基酸序列比對

圖1結果顯示具有同一性的氨基酸共有147個，占24.22%；高度相似的氨基酸共有85個，占14.00%，相似度較低的共有41個，占6.75%，一致性大于50%，同時我們也看到，FtsZ蛋白中保守區域主要在425 Residues之前，盡管根瘤菌屬與慢生根瘤菌屬FtsZ蛋白的氨基酸序列較長，但自424Residue之后的氨基酸隨機性較大，在系統發育學上的研究意義不大。

2.3 FtsZ蛋白的系統發育分析

采用Clustalx 2.1程序將表1所列的32種細菌FtsZ蛋白序列進行比對分析，通過掐頭去尾并優化處理后獲得比對文件，再利用MEGA 7.0軟件將上述文件激活并制作系統發育樹，如圖2所示獲得系統發育拓撲結構圖。

圖2 FtsZ蛋白系統發育樹分析

3 討論

由圖2可看出，FtsZ蛋白成功將根瘤菌進行聚類，埃希氏菌屬的3個菌種歸為外群，根瘤菌下歸屬為兩大分支，第一大分支為伯克霍爾德菌屬和貪銅菌屬聚類，這兩個屬的細菌均屬于β-變形桿菌綱（Betaproteobacteria）；第二大分支主要為根瘤菌屬、慢生根瘤菌屬、土壤根瘤菌屬和中華慢生根瘤菌屬聚類，這4個屬的細菌均屬于α-變形菌綱（Alphaproteobacteria），這一結果與最新版本的《伯杰氏系統細菌學手冊》和近年來國內外文獻中對根瘤菌的系統分類基本一致[2，8]，而這些系統主要是以細菌的16S rRNA 系統發育為依據， 表明FtsZ蛋白作為分子指標具有較高的可靠性。另外，在以上32種細菌FtsZ蛋白氨基酸序列長度差異度較大的情況下，系統發育樹也能明顯將埃希氏菌屬菌種歸于外群，說明在本實驗數據范圍內，FtsZ蛋白的敏感度和分辨力高于16S rRNA 。

一直以來，無論從形態學的角度還是分子指標16S rRNA 的角度來看，Agrobacterium和Rhizobium相似度非常大，因此學術界不斷有學者提出將兩個屬合并為一個屬，從圖2系統發育樹我們發現兩個屬的根瘤菌同樣也被歸屬到了同一分支下，表明從FtsZ蛋白的角度出發兩個屬也極為相似。另外，值得注意的是圖2還將Burkholderia dolosa、Cupriavidus nantongensis這兩個屬于β-變形桿菌綱的菌種和Mesorhizobium plurifarium聚類到一起并歸屬在第二大分支里，而第二大分支的其它菌種均屬于α-變形菌綱。自1898年Frank首次提出根瘤菌屬這一概念以來[9]，很長一段時間人們認為根瘤菌僅分布在α-變形桿菌綱內，直到2001年隸屬于β-變形桿菌綱的根瘤菌被發現后[8]，人們的認識才發生歷史性的轉變——原來根瘤菌不僅僅存在于α-變形桿菌綱內。從本研究的結果來看Burkholderia dolosa與Cupriavidus nantongensis兩個菌種的關系與α-變形菌綱根瘤菌的親緣關系更為接近，再次證明僅依靠α-變形桿菌綱這一大概念將根瘤菌涵蓋是錯誤的觀念。多年來根瘤菌系統學與分類學上一直存在著許多爭議，不同的分類和鑒定指標都存在著或多或少的偏差[10-15]，無論怎樣，我們的目的就是為了認識根瘤菌進化的起源與進化軌跡，尋找保守性較高和變異度適宜的分子指標是根瘤菌系統發育學重要的基礎工作，隨著蛋白組學的發展，學者發現氨基酸序列能提供比核酸序列可信度更高的分析結果[7]，本研究也表明細菌FtsZ蛋白在根瘤菌系統發育學研究方面具有較高的應用價值和意義，有必要結合大數據繼續利用生物信息學手段進行更深入的研究，挖掘根瘤菌更多的進化奧秘。

4 結論

（1）根瘤菌各屬模式菌種FtsZ蛋白序列比對結果表明，序列中同一性的氨基酸共有147個，占24.22%；高度相似的氨基酸共有85個，占14.00%，相似度較低的共有41個，占6.75%，一致性大于50%，FtsZ蛋白中保守區域主要位于425 Residues之前。

（2）以FtsZ蛋白為分子指標制作的系統發育樹與最新版本的《伯杰氏系統細菌學手冊》和近年來國內外文獻中對根瘤菌的系統分類基本一致，同時有些細微差異也與學術界提出的爭議相吻合。

（3）FtsZ蛋白在根瘤菌系統發育學研究方面具有較高的分辨力。

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