胃癌中Cx43與P-Ezrin表達的意義及相關性研究*

張立偉，張愛東，譚淑娟，盧思英，李春輝

(1.承德護理職業學院護理系,河北承德 067000；2.承德醫學院附屬醫院病理科,河北承德 067000)

胃癌在世界范圍內發病率和病死率均較高，間隙連接蛋白43(Cx43)作為間隙連接通道的組成部分，在Cx家族中起關鍵作用，其表達水平的異常與腫瘤的發生發展關系密切。然而Cx43對腫瘤組織基因轉錄及表達水平的下調機制尚未完全明確，成為目前研究的熱點。細胞骨架連接蛋白(Ezrin)連接著細胞膜分子與肌動蛋白絲，且發揮重要作用的是細胞的生長過程中磷酸化的Ezrin(P-Ezrin)，其異常表達可能導致細胞出現生物行為的異常，從而參與腫瘤的發生過程。目前，聯合研究Cx43與P-Ezrin在胃癌中的表達及相關性的研究尚未見報道。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2015年2月至2016年10月期間承德醫學院附屬醫院經病理證實的胃癌手術標本110例，同時選取40例距腫瘤5 cm以上的正常胃組織作對照組，患者在術前均未接受抗癌治療。110例胃癌患者中，男69例，女41例，年齡27～82歲，平均(54.3±5.4)歲；>50歲68例，≤50歲42例。

1.2試劑 (1)免疫組織化學試劑：鼠抗人Cx43、P-Ezrin 一抗抗體、免疫組織化學MaxVision試劑盒和即用型DAB顯色試劑盒(DAB-0031)購自福州邁新公司；磷酸鹽緩沖液(PBS)、蘇木素、伊紅等常規試劑購自北京化學試劑公司。(2)Western blot所用試劑：兔抗人一抗Cx43及P-Ezrin 抗體購自Bioword Technology公司，羊抗兔HRP標記的二抗購自KPL試劑公司，RIPA組織裂解液(BB120031)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、BCA蛋白濃度測定試劑盒及ECL超敏發光液均購自北京索萊寶科技有限公司，30%丙烯酰胺、10%過硫酸銨、顯影粉等均由承德醫學院基礎研究所分子實驗室提供。

1.3方法

1.3.1免疫組織化學 石蠟包埋標本4 μm連續切片，行蘇木素-伊紅(HE)和免疫組織化學染色。3% H2O2孵育10 min封閉滅活內源性過氧化酶；0.01 mol/L(pH 6.0)枸櫞酸鹽緩沖液微波修復抗原10 min；山羊血清工作液37 ℃封閉溫育60 min；37 ℃濕盒中滴加適當濃度一抗，溫育60 min后4 ℃過夜；酶標羊抗鼠/兔IgG聚合物(二抗)室溫孵育15 min；DAB顯色，蘇木素復染核。PBS替代一抗作為陰性對照，已知正常胃組織的陽性切片作為陽性對照。

1.3.2Western blot 取-20 ℃保存的組織提取總蛋白，BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定總蛋白濃度。每孔上樣量為20 μg,電泳、轉膜、放入含5%脫脂奶粉封閉液中封閉；在裝有稀釋好的Ⅰ抗雜交袋中過夜，TBST洗膜3次，每次15 min；加Ⅱ抗孵育2 h后用1×TBST洗膜3次，每次5 min，曝光，觀察結果。

2 結 果

2.1Cx43與P-Ezrin的免疫組織化學結果 40例對照組的標本中，Cx43陽性率為65.0%(26/40)，顯著高于胃癌組19.1%(21/110)。P-Ezrin陽性率為27.5%(11/40)，顯著低于胃癌組74.5%(82/110)，兩組差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖1、2，表1。

A:正常胃黏膜強陽性;B:胃高分化腺癌中等陽性;C:胃低分化腺癌弱陽性。

圖1不同組織中Cx43表達情況(×400)

A:正常胃黏膜陰性;B:胃高分化腺癌弱陽性;C:胃低分化腺癌強陽性。

圖2不同組織中P-Ezrin表達情況(×400)

表1 兩組Cx43與P-Ezrin表達情況

表2 Cx43與P-Ezrin的表達與胃腺癌臨床病理特征的定性分析

2.2Cx43及P-Ezrin表達分析 在40例對照組的胃組織標本中，Cx43蛋白相對表達量(0.95±0.02)高于胃癌組織(0.12±0.03)，差異有統計學意義(P=0.021)，P-Ezrin蛋白相對表達量(0.29±0.03)低于胃癌組織(2.43±0.05)，差異有統計學意義(P=0.01)，在性別和年齡組中差異無統計學意義(P>0.05)，而在其余各組中的差異有統計學意義(P<0.05)，見表2、3，圖3。

表3 Cx43、P-Ezrin表達與胃腺癌臨床特征的定量分析

1:對照組;2:高中分化胃癌組;3:低分化胃癌組。

圖3不同組Cx43、P-Ezrin免疫印跡電泳

表4 Cx43與P-Ezrin在胃癌組織中表達的相關分析

2.3Cx43、P-Ezrin在胃癌中的相互關系 Spearman等級相關分析顯示免疫組織化學檢測結果中Cx43與P-Ezrin在胃癌中的表達呈負相關(r=-0.58，P=0.000),見表4。

3 討 論

間隙連接是細胞間進行信息交流的特殊膜結構，其功能和結構的基礎是間隙連接蛋白。有資料證實，Cx43在多種組織中表達[1]，如上皮細胞、平滑肌細胞、心肌組織等，但在惡性腫瘤組織中卻表達減少甚至缺失[2-5]。本試驗結果顯示，癌旁組織中Cx43蛋白表達遠高于胃癌組織，且進一步發現其表達與患者年齡及性別無關，而與腫瘤的分化程度、淋巴結轉移、腫瘤浸潤深度、臨床分期有關，提示Cx43的缺失可能促進胃癌的發生發展。

Ezrin是參與細胞膜和細胞骨架連接的一種特定蛋白[6]。磷酸化作用使Ezrin構象發生改變而激活，P-Ezrin介導后續的病理生理過程。Ezrin在將肌動蛋白絲與細胞膜相連的同時，會產生一系列細胞功能，如細胞的形態改變、移動、信號轉導、黏附、有絲分裂等，從而影響了腫瘤侵襲轉移等生物學行為。因此，越來越多的研究證實，Ezrin在多種腫瘤中存在高表達[7-10]，與本試驗研究結果相一致。在進一步探討P-Ezrin表達與惡性腫瘤臨床病理特征關系中，多項研究發現P-Ezrin與多類惡性腫瘤的發生、浸潤及轉移密切相關[11-12]，且腫瘤細胞的浸潤和轉移能力在P-Ezrin低表達時受到抑制，反之則增強。顯示P-Ezrin是腫瘤轉移的關鍵因素，并且是預后差的指標[13-14]。本試驗結果顯示P-Ezrin在胃癌中的表達與患者性別和年齡無關，而與胃癌的生物學行為密切相關，低表達者分化程度高、淋巴結轉移少、腫瘤浸潤深度淺、臨床分期低。進一步證實了P-Ezrin在參與了胃癌的發生過程，有高侵襲和轉移傾向。

Cx43在胃癌組織中的表達明顯下降，P-Ezrin的表達則明顯增加，二者呈負相關關系，這可能是由于P-Ezrin自身或通過激活各種信號分子導致 Cx43 磷酸化，從而破壞了細胞間的通信功能，導致細胞間生長控制減弱，這種細胞內和細胞間的信號傳導作用，可能是胃癌發生發展的機制之一，可能成為胃癌藥物治療的潛在作用靶點，但具體機制還有待于研究。

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