血清miR-21和CA199對胰腺癌臨床診斷的應用價值探討

茅肖娜，汪莉莉

(浙江省寧波市鄞州區(qū)第二醫(yī)院檢驗科 315000)

胰腺癌是一種惡性程度和病死率極高的癌癥之一，近年來發(fā)病率呈上升趨勢，嚴重威脅著患者的生命安全[1-2]。胰腺癌在病情早期無明顯癥狀，多數(shù)患者在確診時病情已進展至喪失根治性切除時機，加上胰腺在解剖結構上毗鄰關系復雜，穿刺活檢操作難度大[3]；且胰腺癌具有明顯的侵襲性生物學行為[4]，因此目前主要的診斷手段穿刺活檢對胰腺癌的臨床應用價值非常有限，迫切需要尋求一種能夠在較為早期提示病情且便于操作的診斷方法[5]。檢測血液中的腫瘤標志物在目前惡性疾病的篩查和診斷中發(fā)揮著越來越重要的作用。有研究報道顯示，CA199是一種糖蛋白腫瘤標志物，在胰腺癌患者的血清中水平增加明顯，是目前對胰腺癌診斷最為常用的腫瘤標志物[6]，但其特異度和敏感度均不甚理想[7]。隨著研究的不斷深入，有研究發(fā)現(xiàn)多種惡性疾病的發(fā)生發(fā)展過程中都伴隨著微小RNA(miRNA)的表達變化，miRNA近年來也被作為一種潛在的腫瘤標志物受到了研究者的普遍關注，已有研究指出miR-21對胰腺癌的發(fā)生發(fā)展起著重要作用[8-9]。因此，本研究通過檢測胰腺癌患者血清中的miR-21和CA199的表達情況，并評價其對胰腺癌的診斷價值，旨在為臨床實踐提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2015年1月至2016年6月在本院就診的胰腺癌患者124例(癌癥組)，良性胰腺疾病患者100例(良性對照組)及同期健康體檢者100例(健康對照組)作為觀察對象。其中，癌癥組男59例，女65例，年齡47～72歲，平均(52.7±12.8)歲；良性對照組男51例，女49例，年齡45～76歲，平均(53.9±11.6)歲；健康對照組男53例，女47例，年齡43～74歲，平均(54.2±14.3)歲。所有疾病患者均經(jīng)病理學確診，且入組前未行放療化療及其他免疫療法，健康對照組患者的所有體檢指標均正常。經(jīng)統(tǒng)計分析，3組患者的年齡及性別構成比較差異均無統(tǒng)計學意義(P<0.05)，具有可比性。所有研究對象對本研究均知情同意并簽署知情同意書。

1.2方法 采集所有研究對象的空腹靜脈血，2 h內(nèi)在4 ℃低溫離心機中以4 000 r/min離心10 min，分離血清置于4 ℃保存待測。其中用于檢測miRNA的血清樣本再次以12 000 r/min離心10 min以確保血清樣本中不含任何細胞碎片，置于不含RNA酶的EP管中待測。CA199采用瑞士Roche公司的全自動生化分析儀E170模塊及其配套試劑檢測，嚴格按照儀器操作規(guī)程進行操作，正常參考值范圍小于或等于37 U/mL。miR-21采用德國Qiagen公司提供的miRNeasy Serurn/Plasma試劑盒，按照操作說明書進行，提取200 mL血清中的總RNA并使用脫氧核糖核酸酶(RnaseⅠ)酶解后，使用QIAGEN miScript Reverse Transcripition Kit試劑盒進行反轉錄，按照試劑盒說明書進行操作，最后使用瑞士Roche公司的Real time PCR儀LightCycler Ⅱ480進行檢測，選擇Absoulute Quantification，PCR起始-反應條件為95 ℃ 15 min；而后依次為94 ℃ 15 s變性、55 ℃ 30 s退火、70 ℃ 30 s延伸3步循環(huán)，共循環(huán)40次。內(nèi)參為RNU6，待測樣品和內(nèi)參同時擴增，在96孔板中每個樣品各重復3次，平均Ct值作為樣品的結果Ct值。

2 結 果

2.1不同組別人群miR-21與CA199表達情況比較 癌癥組患者的CA199和miR-21表達量均顯著高于良性對照組和健康對照組(P<0.05)，且良性對照組CA199表達量也顯著高于健康對照組(P<0.05)，而miR-21在良性對照組和健康對照組間的表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 不同組別人群miR-21與CA199表達情況比較

a:P<0.05，與良性對照組比較；b:P<0.05，與健康對照組比較

2.2CA199與miR-21對鑒別健康人群和胰腺癌患者的診斷價值情況 單獨用于鑒別健康人群和胰腺癌患者時，CA199的敏感度和特異度均不高，分別為63.71%和56.00%，均顯著低于miR-21的敏感度和特異度(79.84%和78.00%)，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。當兩者聯(lián)合時，其靈敏度和特異度較單獨使用時有顯著升高，曲線下面積明顯增加，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表2、圖1。

表2 CA199與miR-21對區(qū)分健康人群和胰腺癌患者的診斷價值情況

a:P<0.05，與CA199比較；b:P<0.05，與miR -21比較

圖2 CA199與miR-21對鑒別健康人群和胰腺癌患者的ROC曲線

2.3CA199與miR-21對鑒別良性胰腺疾病和胰腺癌患者的診斷價值情況 單獨用于鑒別良性胰腺疾病和胰腺癌患者時，CA199的敏感度和特異度分別為53.23%和51.00%，均顯著低于miR-21的敏感度和特異度(72.58%和74.00%)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。當兩者聯(lián)合時，其靈敏度和曲線下面積較單獨使用有明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但特異度與單用miR-21比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表3、圖2。

表3 CA199與miR-21對鑒別良性胰腺癌疾病和胰腺癌患者的診斷價值情況

aP<0.05，與CA199比較；bP<0.05，與miR -21比較

圖2 CA199與miR-21對區(qū)分良性胰腺癌疾病和胰腺癌患者的ROC曲線

3 討 論

胰腺癌是一種惡性程度和病死率都很高的疾病，現(xiàn)已成為消化系統(tǒng)惡心疾病導致患者死亡的主要原因之一，嚴重威脅著患者的生命健康[10]。手術切除是目前惟一可能治愈胰腺癌的治療手段，然而如前文所述，胰腺癌患者在發(fā)病早期并無明顯的臨床癥狀或體征，更無特異性表現(xiàn)，加上胰腺解剖位置毗鄰臟器多，組織活檢的應用受到限制[11]。目前胰腺癌的診斷主要依賴于影像學檢查，但對胰腺癌診斷的敏感度和特異度不甚理想，尤其是難以發(fā)現(xiàn)早期病變。多種原因使得多數(shù)患者在確診時已發(fā)展至病情晚期而失去了手術切除的機會，因此臨床迫切需要探尋更為簡便的篩查和診斷胰腺癌的技術手段。

CA199是目前臨床應用較為普遍的一種篩查胰腺癌的腫瘤標志物，已有諸多研究報道指出CA199對胰腺癌的診斷具有較好的敏感度和特異度，且根據(jù)胰腺癌患者血清CA199的水平對判斷胰腺癌手術患者的預后及術后復發(fā)情況也具有較好的預測價值[12]。但也有研究指出CA199表達升高缺乏特異性，可見于多種疾病，如肝膽疾病或良性胰腺疾病等，且有數(shù)據(jù)指出約有30%的胰腺癌患者可不出現(xiàn)血漿中CA199表達增高[13]。本研究中的數(shù)據(jù)也顯示，CA199在胰腺癌患者和良性胰腺疾病患者均有高表達，在區(qū)分健康人群與胰腺癌患者、良性胰腺疾病患者與胰腺癌患者方面，其敏感度和特異度均不高，這使得CA199對胰腺癌診斷的應用價值受到限制。因此，在臨床實踐中仍需要聯(lián)合其他指標。

關于CA199與其他腫瘤標志物聯(lián)合應用于診斷胰腺癌的臨床研究，近年來已有較多的相關報道，如將CA199與miRNA聯(lián)合時，可明顯提高對良性胰腺疾病與胰腺癌的診斷敏感度和特異度，且有助于早期診斷胰腺癌[14]。諸多研究已證實多種miRNA在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展中的起著重要作用[15-17]，在此不做贅述。研究表明，miR-21在胰腺癌患者中表達明顯升高，指出miR-21是一種胰腺癌化療相關的腫瘤標志物，且其高表達往往預示著預后差，在預測患者預后方面具有潛在的應用價值[18]。潘文征等[19]研究共檢測了胰腺癌患者血漿中6種miRNA(分別是miR-21、miR-210、miR-155、miR-196a、miR-20a、miR-25)的表達情況，發(fā)現(xiàn)miR-21對胰腺癌的單獨診斷價值最高。郭學青等[20]新近報道的研究數(shù)據(jù)顯示miR-21對于胰腺癌具有一定的輔助診斷價值，與CA199聯(lián)合檢測可以為臨床胰腺癌的診斷提供一種潛在的輔助診斷方法。但該研究未比較CA199與miR-21在單用時的診斷價值，且該研究中發(fā)現(xiàn)miR-21在良性胰腺疾病中也有顯著升高，與劉建強等[21]報道的數(shù)據(jù)存在一定的矛盾，究其原因，可能與兩項研究納入的病例數(shù)均較小有關，且其他研究也指出miR-21對胰腺癌的診斷價值仍需要進一步多中心大樣本的研究加以證實[22]。為了進一步探討miR-21的應用價值，因此本研究分析了miR-21與CA199聯(lián)合應用時對胰腺癌的診斷價值。結果顯示，胰腺癌患者的miR-21表達量顯著高于良性胰腺疾病患者和健康對照人群，而在良性胰腺疾病患者和健康對照人群之間，其表達量未見明顯差異，這一結果提示miR-21對篩查胰腺癌具有一定的特異性；在診斷價值方面，本研究分別從區(qū)分健康人群和胰腺癌患者、良性胰腺疾病和胰腺癌患者兩個角度分析比較CA199與miR-21及其聯(lián)合使用時的診斷價值，結果顯示miR-21的敏感度和特異度均優(yōu)于CA199，其診斷價值更高，兩者聯(lián)合應用有助于提高對胰腺癌的診斷價值。

綜上所述，當前胰腺癌的診斷和治療水平仍未達到臨床需求，尤其是提高胰腺癌早期診斷能力仍然是目前臨床迫切而具有挑戰(zhàn)的難題。CA199作為目前應用較為廣泛的一種腫瘤標志物，其敏感度和特異度欠佳；miR-21是新近發(fā)現(xiàn)的一種標志物，其診斷價值優(yōu)于CA199，兩者聯(lián)合應用有助于提高對胰腺癌的診斷鑒別能力。

[1]劉鵬飛，張劍青．循環(huán)miRNAs與胰腺癌早期診斷的研究進展[J]．現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學，2017，25(4)：638-640．

[2]鐘志惟，殷香保．胰腺癌的分子靶向治療研究進展[J]．中國普通外科雜志，2016，25(9)：1351-1356．

[3]WANG P,ZHUANG L P,ZHANG J,et al.The serum miR-21 level serves as a predictor for the chemosensitivity of advanced pancreatic cancer,and miR-21 expression confers chemoresistance by targeting FasL[J].Mol Oncol,2013,7(3):334-345.

[4]陳文舉,陳美芳,王攀,等.血清miR-210和CA199聯(lián)合檢測在胰腺癌診斷中的應用[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志,2015,26(20):3481-3483.

[5]KHURUM K,DAVID C,CLARE P,et al.miR-21 expression and clinical outcome in locally advanced pancreatic cancer:exploratory analysis of the pancreatic cancer erbitux,radiotherapy and UFT(Peru)trial[J].Oncotarget,2016,7(11):12672-12681.

[6]SZAJDA S D,WASZKIEWICZ N,CHOJNOWSKA S,et al.Carbohydrate markers of pancreatic cancer[J].Biochem Soc Trans，2011，39(1):340-343.

[7]陳俊華，趙美芳，李雪芬，等．胰腺癌腫瘤標志物的研究進展[J]．國際檢驗醫(yī)學雜志，2009，30(2)：141-143,146．

[8]SLOTWINSKI R,SLOTWINSKA S M.Diagnostic value of selected markers and apoptotic pathways for pancreatic cancer[J].Cent Eur J Immunol,2016,41(4):392-403.

[9]吳陽，黃李雅，王佐正，等．MicroRNA在胰腺癌血漿中的表達及臨床意義[J]．寧夏醫(yī)科大學學報，2016，38(6)：620-623．

[10]楊柳，閆歡，石燕，等．晚期胰腺癌患者血清CA125,CA199水平與肝轉移的關系[J]．中國實驗診斷學，2017，21(5)：770-773．

[11]李翠芬．胰腺癌血清腫瘤標志物聯(lián)合檢測的意義及中醫(yī)治療對腫瘤標記物的影響[J]．遼寧中醫(yī)雜志，2015(10)：1917-1919．

[12]楊鵬，趙建勇，江建新．血清 Try-2 CA 199 CA125與胰腺癌的相關性研究[J]．河北醫(yī)學，2015，21(9)：1413-1415．

[13]林文科，吳吉芳，鄭志昂．多種腫瘤標志物在胰腺癌中的診斷價值及相關性研究[J]．中國免疫學雜志，2017，33(1)：120-125．

[14]朱成林，余安，黃強．用于胰頭癌可切除性判斷的術前血清標志物篩選[J]．中國普通外科雜志，2017，26(3)：265-270．

[15]趙欣，尤勝義．miRNA 在胰腺癌發(fā)生發(fā)展及臨床應用中的研究進展[J]．山東醫(yī)藥，2015,59(24)：101-103．

[16]王熠，熊龍輝，賀德．微RNA與胰腺癌研究進展[J]．醫(yī)學綜述，2016，22(11)：2124-2127．

[17]YUAN W,TANG W,XIE Y,et al.New combined microRNA and protein plasmatic biomarker panel for pancreatic cancer[J].Oncotarget,2016,7(48):80033-80045.

[18]KARAMITOPOULOU E,HAEMMIG S,BAUMGARTNER U A,et al.MicroRNA dysregulation in the tumor microenvironment influences the phenotype of pancreatic cancer[J].Modern Pathology,2017,30(8):1116-1125.

[19]潘文征．與胰腺癌診斷相關血漿miRNA的研究[D]．濟南：山東大學，2014．

[20]郭學青，高宏偉，李曉陽．血清miR-21與CA199聯(lián)合檢測對胰腺癌診斷的臨床意義[J]．中華檢驗醫(yī)學雜志，2017，40(5)：400-403．

[21]劉建強，高軍，任艷，等．血漿miR-21對胰腺癌的診斷價值[J]．世界華人消化雜志，2011(8)：860-863．

[22]劉書中，李子全，李政垚，等．外周血 miR-21檢測在胰腺癌中的意義研究進展[J]．中國實驗診斷學，2016，20(6)：1038-1042．