microRNA-622調(diào)控DYRK2在結(jié)腸癌中表達(dá)并促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞SW1116侵襲轉(zhuǎn)移*

魏晰麟，杜健峰，王 勇，盧佳寧，婁 琳，孫 潔，周忠笑，張 健，曾憲東

(沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院普外三科 110024)

作為消化系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，結(jié)腸癌被認(rèn)作是腫瘤相關(guān)死亡的常見(jiàn)原因之一。持續(xù)積累的基因?qū)W及表觀遺傳學(xué)失調(diào)控與結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[1]。盡管包括手術(shù)、放療、化療在內(nèi)的多種治療方式均取得了不錯(cuò)的進(jìn)展，但結(jié)腸癌患者5年生存率依然不高[2]。結(jié)腸癌的不佳預(yù)后往往認(rèn)為與其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和高復(fù)發(fā)率密切相關(guān)[3]。

微小RNA(microRNAs，miRNAs)是一組進(jìn)化上相對(duì)保守的非編碼RNA，其在多種腫瘤中通過(guò)調(diào)控靶基因的表達(dá)而被認(rèn)為是癌基因或抑癌基因參與到腫瘤的多種生物學(xué)行為中[4]。miR-622位于人類(lèi)基因組13q31.3染色體，并被報(bào)道作為抑癌基因參與到包括肝癌、肺癌及膠質(zhì)瘤等多種惡性腫瘤中[5-7]。目前，關(guān)于miR-622在結(jié)腸癌中的功能尚有爭(zhēng)議。BALAGUER等[8]通過(guò)miRNA芯片研究發(fā)現(xiàn)，相比于癌旁組織，miR-622在結(jié)腸癌組織中呈相對(duì)高表達(dá)。到目前為止，關(guān)于miR-622是否可以影響結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移及其具體機(jī)制未見(jiàn)報(bào)道。

本研究擬在組織學(xué)及細(xì)胞學(xué)水平探討結(jié)腸癌中miR-622及雙重特異性酪氨酸調(diào)節(jié)激酶2(dual-specificity tyrosine-regulated kinases 2，DYRK2)的表達(dá)并進(jìn)行相關(guān)性分析，同時(shí)研究miR-622過(guò)表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞SW1116中DYRK2表達(dá)及其侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。

1 材料與方法

1.1組織細(xì)胞來(lái)源及主要試劑盒、儀器

1.1.1結(jié)腸癌組織標(biāo)本來(lái)源 82例結(jié)腸癌及癌旁組織標(biāo)本均來(lái)自2014年2月至2016年2月沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院結(jié)腸癌手術(shù)過(guò)程中切取的新鮮結(jié)腸癌組織及相應(yīng)的癌旁組織，液氮保存運(yùn)送并置于-80 ℃低溫冰箱保存。術(shù)后均經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)診斷為結(jié)腸癌，其中男55例，女27例，患者手術(shù)前未行放療及化療，年齡42～75歲，平均58歲。

1.1.2細(xì)胞來(lái)源 結(jié)腸癌細(xì)胞系SW1116、SW480及正常結(jié)腸上皮細(xì)胞系NCM460細(xì)胞購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.1.3主要試劑及儀器 RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒及LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)；SYBR Master Mixture(日本Takara公司)；DYRK2多克隆抗體(美國(guó)Cell Signaling Technology公司)；HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(武漢博士得公司)；miR-622 mimics(miR-622 mimics組)及mimic control(NC組)引物由上海生工生物工程(上海)有限公司合成； Transwell小室(安徽Corning公司)。

1.2結(jié)腸癌組織中miR-622、DYRK2的檢測(cè)

1.2.1Real-time PCR檢測(cè)miR-622、DYRK2 mRNA表達(dá) Trizol提取結(jié)腸癌組織及培養(yǎng)的各組細(xì)胞總RNA并標(biāo)記。按照Invitrogen的試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物行PCR擴(kuò)增，PCR過(guò)程按Invitrogen的SYBR Green 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒說(shuō)明書(shū)在熒光定量?jī)x上進(jìn)行，以U6為miR-622的內(nèi)參，β-actin為DYRK2的內(nèi)參。以miR-622與U6拷貝數(shù)的比值為其相對(duì)表達(dá)量，DYRK2與β-actin拷貝數(shù)的比值為其相對(duì)表達(dá)量。miR-622 RT-PCR引物5′-GTC GTA TCC AG T GCG TGT CGT GGA GTC GGC AAT TGC ACT GGA TAC GAC GCT CCA-3′；miR-622 PCR上游引物5′-GGG ACA GTC TGC TGA GGT-3′，miR-622 PCR下游引物5′-CAG TGC GTG TCG TGG AGT-3′；U6上游引物5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′，U6下游引物5′-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3′；DYRK2上游引物5′-CCT GAA CAA GCA ATGAA GCA-3′； DYRK2下游引物5′-GGT CAT CAT CAT AGC CAC CA-3′；β-actin上游引物5′-AGT GTG ACG TGG ACA TCC GCA AAG-3′，β-actin下游引物5′-ATC CA C ATC TGC TGG AAG G TG GAC-3′。

1.2.2Western blot檢測(cè)DYRK2蛋白表達(dá) 分別提取組織總蛋白，BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，取200 μL樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)膜，封閉1 h后，依次行一抗(兔抗人DYRK2和兔抗人β-actin)、二抗(HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗)雜交，最后按增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)試劑盒說(shuō)明書(shū)行電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，應(yīng)用Quantity One軟件行蛋白灰度分析。

1.2.3DYRK2蛋白的免疫組織化學(xué)檢測(cè) 組織標(biāo)本取材后，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗，依次行石蠟包埋切片、脫蠟復(fù)水、抗原修復(fù)、封閉、過(guò)氧化物酶及1%牛血清清蛋白(BSA)封閉、一抗及二抗孵育、DAB顯色、復(fù)染、封片。細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色或棕色為陽(yáng)性。

1.3SW1116、SW480和NCM460細(xì)胞中miR-622、DYRK2的檢測(cè) 結(jié)腸癌細(xì)胞系SW1116及SW480細(xì)胞及正常結(jié)腸上皮細(xì)胞系NCM460細(xì)胞均培養(yǎng)于添加10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)。定期換液，細(xì)胞生長(zhǎng)融合至70%～80%時(shí)常規(guī)傳代。細(xì)胞中的miR-622及DYRK2 mRNA采用Real time PCR法檢測(cè)，具體同1.2.1。DYRK2蛋白的檢測(cè)用Western blot法，具體同1.2.2。

1.4細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力檢測(cè) 選取生長(zhǎng)狀態(tài)佳的SW1116細(xì)胞，胰酶消化并調(diào)整細(xì)胞密度為每升2×105個(gè)并分組接種于24孔板中，37 ℃、5% CO2孵育24 h，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法分別轉(zhuǎn)染50 nmol miR-622 mimics或mimic control。37 ℃孵育6 h，添加500 μL RPMI-1640完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后，進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。采用Real time PCR法檢測(cè)miR-622及DYRK2 mRNA，采用Western blot法檢測(cè)DYRK2蛋白。參照Transwell小室說(shuō)明書(shū)，常規(guī)包被底部膜，水化；同步化各組SW1116細(xì)胞，調(diào)整計(jì)數(shù)并接種，上室內(nèi)加入100 μL含10% 胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基；下室內(nèi)加入500 μL含20% 胎牛血清的RPMI-1640，37 ℃、5% CO2孵育48 h。取出Transwell小室，棉簽擦去Transwell小室內(nèi)部細(xì)胞，沖洗，固定，染色，倒置顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)。每組鋪6個(gè)Transwell 小室，平均值即細(xì)胞侵襲的數(shù)量。

2 結(jié) 果

2.1結(jié)腸癌組織中miR-622和DYRK2的表達(dá)及相關(guān)性分析 結(jié)腸癌組織及癌旁組織配對(duì)標(biāo)本中miR-622和DYRK2 mRNA的表達(dá)及DYRK2蛋白的表達(dá)見(jiàn)圖 1、2及表1。與癌旁組織比較，Real time PCR和Western blot結(jié)果顯示結(jié)腸癌組織中DYRK2 mRNA和蛋白呈低表達(dá)；免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，隨著結(jié)腸癌臨床分期的增加，DYRK2表達(dá)呈明顯降低趨勢(shì)。與癌旁組織比較，Real time PCR結(jié)果顯示結(jié)腸癌組織中miR-622 mRNA表達(dá)升高。Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，在結(jié)腸癌組織中miR-622與DYRK2表達(dá)呈明顯負(fù)相關(guān)(r=0.916,P<0.05)。此外統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)miR-622高表達(dá)和DYRK2低表達(dá)均與結(jié)腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.004、0.004)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P=0.016、0.010)，見(jiàn)表2。

1：癌旁組織；2：結(jié)腸癌組織

圖1結(jié)腸癌及癌旁組織配對(duì)標(biāo)本中DYRK2蛋白的Western blot檢測(cè)

表1 結(jié)腸癌及癌旁組織配對(duì)標(biāo)本中miR-622和DYRK2的表達(dá)比較

A:臨床分期Ⅰ期；B：臨床分期Ⅱ期；C：臨床分期Ⅲ期；D：臨床分期Ⅳ期

圖2不同臨床分期結(jié)腸癌組織中DYRK2的表達(dá)情況(SP×200)

圖3 結(jié)腸癌組織中miR-622與DYRK2的表達(dá)的相關(guān)性分析(R2=0.916)

2.2結(jié)腸癌細(xì)胞系SW1116、SW480及正常結(jié)腸上皮細(xì)胞系NCM460中miR-622和DYRK2的表達(dá) 結(jié)腸癌細(xì)胞系SW1116、SW480及正常結(jié)腸上皮細(xì)胞系NCM460中miR-622和DYRK2的表達(dá)情況見(jiàn)圖4、表3。與NCM460比較，SW1116(t=640.00)、SW480(t=954.37)細(xì)胞中miR-622 mRNA表達(dá)水平明顯升高(均P<0.01)；而DYRK2 mRNA(t=-256.23、-225.18)和蛋白(t=-160.25、-190.87)表達(dá)水平明顯降低(均P<0.01)。

表2 結(jié)腸癌中miR-622和 DYRK2 的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性分析

2.3miR-622 mimics轉(zhuǎn)染細(xì)胞后miR-622及DYRK2的表達(dá)及結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的變化 與NC組比較，miR-622 mimics組SW1116細(xì)胞miR-622 mRNA表達(dá)上調(diào)，DYRK2 mRNA及蛋白表達(dá)水平下調(diào)，見(jiàn)圖5、表4。進(jìn)一步的Transwell小室試驗(yàn)結(jié)果提示，NC組穿過(guò)小室的細(xì)胞數(shù)為(75.231±5.350)個(gè)，miR-622 mimics組穿過(guò)小室的細(xì)胞數(shù)為(273.45±8.345)個(gè)，miR-622 mimics組較NC組明顯增加(t=-136.044，P<0.01)，即細(xì)胞的侵襲能力增強(qiáng)。

1：NCM460細(xì)胞；2：SW1116細(xì)胞；3：SW480細(xì)胞

圖4 SW1116、SW480及NCM460細(xì)胞系中DYRK2蛋白的Western blot檢測(cè)

a:P<0.01,與NCM460比較

1：NC轉(zhuǎn)染組；2：miR-622 mimics轉(zhuǎn)染組

圖5 miR-622 mimics轉(zhuǎn)染SW1116細(xì)胞后DYRK2蛋白的Western blot檢測(cè)

3 討 論

miRNA是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的長(zhǎng)約22nt的非編碼RNA，其在腫瘤中的作用主要是作為重要的調(diào)節(jié)因子參與到腫瘤發(fā)生發(fā)展的過(guò)程中。miR-622在多種腫瘤中均有報(bào)道。GUO等[9]報(bào)道下調(diào)miR-622的表達(dá)可促進(jìn)胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移；WANG等[10]報(bào)道上調(diào)miR-622表達(dá)可抑制惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、運(yùn)動(dòng)與侵襲。而關(guān)于miR-622在結(jié)腸癌中的功能目前尚存爭(zhēng)議。FANG等[11]報(bào)道m(xù)iR-622在結(jié)腸癌組織及細(xì)胞中表達(dá)降低，上調(diào)其表達(dá)可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移能力；而MA等[12]報(bào)道m(xù)iR-622在結(jié)腸癌中呈高表達(dá)，且miR-622的表達(dá)增高與結(jié)腸癌細(xì)胞的放射抵抗和不良預(yù)后密切相關(guān)。在本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)miR-622在結(jié)腸癌組織及細(xì)胞系SW1116及SW480中呈高表達(dá)，筆者通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方式進(jìn)一步上調(diào)miR-622后發(fā)現(xiàn)上調(diào)的miR-622可明顯促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞SW116的侵襲能力，證實(shí)miR-622在結(jié)腸癌中起到了癌基因的作用。

DYRK2 隸屬于CMGC蛋白激酶超家族，主要分布于細(xì)胞質(zhì)中，其主要作用被認(rèn)為與細(xì)胞功能的多重效監(jiān)管有關(guān)[13]。DYRK2的主要功能是作為GSK3的啟動(dòng)激酶而存在，DYRK2可直接作用于其底物c-Jun和c-Myc從而參與細(xì)胞周期的調(diào)控。DYRK2在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中同樣起著非常重要的作用。DYRK2在包括乳腺癌、膀胱癌、小細(xì)胞肺癌等在內(nèi)的多種惡性腫瘤中均扮演著抑癌基因的角色[14-17]。DYRK2可通過(guò)磷酸化色氨酸從而反應(yīng)性地增強(qiáng)p53的促凋亡作用[18]。DYRK2在腫瘤中的另一個(gè)功能被認(rèn)為與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。DYRK2可通過(guò)磷酸化其下游的Snail，從而參與Snail介導(dǎo)的腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵過(guò)程——上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)。本研究的另一個(gè)重點(diǎn)即是miR-622對(duì)DYRK2表達(dá)的影響。研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-622 mimics后，miR-622表達(dá)水平明顯上調(diào)，相應(yīng)的，DYRK2的mRNA及蛋白表達(dá)水平均相應(yīng)地下調(diào)，證實(shí)miR-622可負(fù)性調(diào)控DYRK2的表達(dá)。微小RNA功能的實(shí)現(xiàn)被認(rèn)為通過(guò)靶向結(jié)合于目的mRNA的3′非編碼區(qū)從而在轉(zhuǎn)錄水平或轉(zhuǎn)錄后水平引起目的mRNA的降解或影響蛋白質(zhì)的翻譯。本研究?jī)H僅初步驗(yàn)證了miR-622對(duì)DYRK2的定性調(diào)控作用，miR-622能否靶向結(jié)合于DYRK2 mRNA的3′非編碼區(qū)并靶向調(diào)控其蛋白的表達(dá)尚需進(jìn)一步的LUC基因報(bào)告等試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌中miR-622表達(dá)升高而DYRK2表達(dá)降低，上調(diào)miR-622可負(fù)性調(diào)控DYRK2表達(dá)并促進(jìn)SW1116細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移，為結(jié)腸癌的基因靶向治療提供了新視角。

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