大鼠熱應激對細胞免疫學的影響

周文蕓，呂芷嫻，曾黎峰，何 丹，胡國柱

(江西省人民醫院臨床醫學研究所，南昌 330006)

熱應激是指在高溫環境中的機體對過熱刺激所產生的非特異性生理反應，其中包括呼吸、心率加快、缺氧等；細胞氧化代謝及過氧化物產生增加；水和電解質平衡紊亂。然而熱應激最初反應是神經內分泌紊亂，交感神經系統及腦垂體-丘腦下部-腎上腺系統功能亢進，免疫受到抑制。狗熱應激42.3 ℃90 min，外周血淋巴細胞持續8 d減少，有絲分裂原刺激T細胞增殖也被抑制[1]。熱應激的孕牛其產下的小牛4周內Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)表達下降，淋巴細胞數量減少[2]。大鼠熱應激腸系膜淋巴結CD3+CD4+T細胞減少，而CD3+CD8+T細胞增加[3]。20～40歲的男性志愿者熱應激，其血漿去甲腎上腺素/腎上腺素、去甲腎上腺素/皮質醇，以及白細胞介素4/Ⅱ型干擾素(IL-4/IFN-γ)的比值升高，證明交感神經系統參與免疫抑制調節，同時免疫調節向輔助T細胞(Th2)方向發展[4]。動物慢性熱應激增加了H5N1流感病毒感染的易感性，抑制了Th1和Th2 免疫反應，降低了H5N1流感病毒疫苗免疫接種后的保護作用，其原因是慢性熱應激誘導動物CD4+CD25+Foxp3+調節性T(Treg)細胞產生，IL-10和TGF-β產生增加[5]。少突細胞髓鞘糖蛋白[MOG(35-55)]肽接種小鼠2 d開始熱應激，結果實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)的發生率減少了70%，且延遲發病，癥狀減輕，白細胞浸潤減少，CD4+CD25+T細胞減少，MOG(35-55)活化的T細胞也下降[6]。

TLR4是識別細菌脂多糖(LPS)、一些病毒及原蟲等病原相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)的識別受體(pattern recognition receptors，PRR)，主要表達于單核/巨噬細胞、樹突狀細胞、粒細胞及自然殺傷(NK)細胞，TLR4在脾和外周血白細胞表達最強。TLR4與PAMPs 結合起到清除病原微生物的天然免疫[7]和特異性免疫作用[8]。

TLR4具有天然免疫和特異性免疫雙重作用。CD4+CD25+FoxP3+Treg和CD8+CD25+FoxP3+Treg均為Treg細胞[9]。因此，本文觀察熱應激大鼠脾臟細胞TLR4表達及外周血兩種Treg細胞的變化，以期為高溫高濕所致疾病的預防提供理論基礎，現報道如下。

1 材料與方法

1.1材料 SPF級SD大鼠(上海市西普爾-必凱實驗動物有限公司)72只，雄性，體質量(267.26±31.08)g，鼠齡9～15周。LPS和刀豆素A(Con-A，Sigma公司)；抗PE-TLR4(Abcam公司)及抗PE-IgG2b k(eBioscience公司)；抗PE-Cy5-CD4(BD Pharmingen公司)及抗PE-Cy5-IgG2a k(eBioscience公司)；抗PE-CD25及抗PE-IgG1，抗FITC-Foxp3及抗FITC-IgG2a，抗FITC-CD8b及抗FITC-IgG1，抗PE-Cy5-Foxp3及抗PE-Cy5-IgG2a；Foxp3 Fixation/Permeabilization及Permeabilization緩沖液(eBioscience公司)。

1.2方法

1.2.1分組 (1)正常對照組(20 ℃組)36只大鼠分為非刺激組、LPS刺激組(腹腔注射LPS,1.0 mg/kg)，Con-A刺激組(腹腔注射Con-A,5.0 mg/kg)，每組12只，自然環境飼養，自由進食進水，濕度50%；(2)高溫濕熱組(37 ℃組)組36只大鼠分為非刺激組、LPS刺激組、Con-A刺激組，每組12只，37 ℃培養箱中飼養，自由進食進水，飽和濕度(100%)；每組觀察時間點為處理后1、12、48、168 h時間點(3只大鼠/時間點)。

1.2.2脾臟單個核細胞懸液制備 大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，取脾臟用含1.0%小牛血清(FCS)+0.03% NaN3的0.01 mol/L PBS(pH 7.4)經200目不銹鋼網研磨制成細胞懸液，離心洗滌2次，調整細胞濃度為1×107個/mL。

1.2.3脾臟TLR4+測定 采用流式細胞術方法：10.0 μL TLR4-PE抗體(1.0 μg)加至塑料試管底，再加同型對照抗體5.0 μL于另一管，然后每管加5×108個/L脾臟細胞混勻，室溫孵育40 min；再加90.0 μL紅細胞裂解液孵育10 min；最后加2.0 mL PBS 400×g離心力離心5 min，洗滌2次。加0.4 mL流式細胞儀鞘液混勻后進行流式細胞儀檢測。

1.2.4Treg細胞檢測 CD4+CD25+T細胞及CD4+CD25+Foxp3+T細胞，CD8+CD25+T細胞及CD8+CD25+Foxp3+Treg測定采用流式細胞術方法，具體步驟見參考文獻[10]。

2 結 果

2.1高溫濕熱影響大鼠脾臟TLR4+細胞的數量 37 ℃高溫濕熱導致大鼠脾臟TLR4+細胞數量下降(P<0.05)，即使LPS和Con-A刺激大鼠也無法逆轉這種免疫抑制狀態，提示高溫濕熱可破壞機體天然免疫功能，見表1～3。

表1 非刺激亞組不同時間點TLR4+細胞比較

a：P<0.05,與同時間點20 ℃比較;b：P<0.05與同組1 h比較

表2 LPS刺激亞組不同時間點TLR4+細胞比較

a：P<0.05,與同時間點20 ℃比較;b：P<0.05,與同組1 h比較

2.2高溫濕熱影響大鼠外周血CD4+CD25+Treg細胞表達 37 ℃高溫濕熱各亞組外周血CD4+CD25+Treg細胞在1～48 h較20 ℃顯著下降(P<0.05)，只有LPS刺激168 h則較20 ℃顯著升高(P<0.05)，見表4～6。

表3 Con-A刺激亞組不同時間點TLR4+細胞比較

a：P<0.05,與同時間點20 ℃比較;b：P<0.05，與同組1 h比較

表4 非刺激亞組不同時間點外周血CD4+CD25+Treg細胞比較

a：P<0.05,與同時間點20 ℃比較;b:P<0.05，與同組1 h,12 h,48 h比較

表5 LPS刺激亞組不同時間點外周血CD4+CD25+Treg細胞比較

a：P<0.05，與同時間點20 ℃比較;b:P<0.05，與同組1 h,12 h比較;c:P<0.05，與同組1 h,12 h,48 h比較

表6 Con-A刺激亞組不同時間點外周血CD4+CD25+Treg細胞比較

a:P<0.05，與同時間點20 ℃比較;b:P<0.05，與同組1 h,12 h,48 h比較

2.3高溫濕熱影響大鼠外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞表達 37 ℃高溫濕熱各亞組外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞所占CD4+CD25+Treg細胞的百分率在12 h高于20 ℃組(P<0.05)，而168 h則顯著低于20 ℃組(P<0.05)，LPS刺激使12 h相對降低。168 h長期高溫濕熱導致外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞顯著減少，可能改變機體的免疫狀態，見表7～9。

表7 非刺激亞組不同時間點外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞比較

a:P<0.05,與同時間點20 ℃比較;b:P<0.05,與同組1 h,48 h,168 h比較;c:P<0.05,與同組1 h比較;d:P<0.05,與同組12 h,48 h比較

2.4高溫影響大鼠外周血CD8+CD25+Treg細胞表達 37 ℃高溫濕熱各亞組在1 h和168 h外周血CD8+CD25+Treg細胞較20 ℃升高(P<0.05)，LPS和Con-A刺激也未明顯改變這種規律，見表10～12。

表8 LPS刺激亞組不同時間點外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞比較

a:P<0.05,與同時間點20 ℃比較;b:P<0.05,與同組1 h,168 h比較

表9 Con-A刺激亞組不同時間點外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞比較

a:P<0.05,與同時間點20 ℃比較;b:P<0.05,與同組12 h,48 h比較;c:P<0.05,與同組12 h,48 h比較

表10 非刺激亞組不同時間點外周血CD8+CD25+Treg細胞均數間的比較

a:P<0.05,與同時間點20 ℃比較;b:P<0.05,與同組12,48 h比較

表11 LPS刺激亞組不同時間點外周血CD8+CD25+Treg細胞比較

a:P<0.05,與同時間點20 ℃比較;b:P<0.05,與同組12 h,48 h比較

表12 Con-A刺激亞組不同時間點外周血CD8+CD25+Treg細胞均數間的比較

a:P<0.05,與同時間點20 ℃比較;b:P<0.05,與同組12 h,48 h比較

表13 非刺激亞組不同時間點外周血CD8+CD25+Foxp3+Treg細胞比較

a:P<0.05,與同時間點20 ℃比較;b:P<0.05,與同組1 h,48 h,168 h比較

2.5高溫濕熱影響大鼠外周血CD8+CD25+Foxp3+Treg細胞表達 37 ℃高溫濕熱非刺激和LPS刺激亞組在12 h和168 h外周血CD8+CD25+Foxp3+Treg細胞較20 ℃顯著升高(P<0.05)，而Con-A刺激亞組在37 ℃ 168 h則恢復正常，見表13～15。

表14 LPS刺激亞組不同時間點外周血CD8+CD25+Foxp3+Treg細胞比較

a:P<0.05,與同時間點20 ℃比較;b:P<0.05,與同組1 h,48 h,168 h比較

表15 Con-A刺激亞組不同時間點外周血CD8+CD25+Foxp3+Treg細胞均數間的比較

a:P<0.05,與同時間點20 ℃比較;b:P<0.05,與同組1 h,168 h比較

3 討 論

TLR4存在于髓系非特異性免疫活性細胞上參與固有免疫和獲得性免疫反應[8]，因此免疫活性細胞TLR4表達下降不但導致非特異性免疫功能下降，同時也降低了特異性免疫反應。TLR4的刺激劑LPS能夠刺激DCs表達TLR4增加，促進DCs上的TLR4對病原和異物進行內吞[11]。小鼠靜脈注射LPS 1～5 h后脾組織TLR4、CD14和TNF-α的mRNA表達逐漸增加[12]。本研究證明大鼠在37 ℃飽和濕度(100%濕度)熱應激時脾臟TLR4+免疫活性細胞數量在1～168 h均顯著降低，TLR4的激動劑LPS也未能在1～12 h促進脾臟免疫活性細胞表達TLR4增加，在48～168 h也未能恢復，而T淋巴細胞有絲分裂原Con-A刺激更不能改變TLR4表達被抑制的狀態，見表1～3。

熱應激引起交感神經系統(去甲腎上腺素)和下丘腦-垂體-腎上腺系統(腎上腺素)的亢進，然而腎上腺素能促進LPS刺激的巨噬細胞吞噬指數增加、TNF-α、IL-1β分泌，以及CD14表達[13]，也有報道證明腎上腺素抑制LPS誘導的單核細胞IL-1β、IL-8、MCP-1的產生，以及CD11b的表達[14]。本研究發現非刺激組及48～168 h的LPS亞組即使腎上腺素應激激素下降后脾臟免疫細胞TLR4表達率仍顯著下降，說明高溫高濕環境下大鼠天然免疫受抑制可能是多因素共同作用的結果。

去甲腎上腺素升高經β2腎上腺能受體導致人和小鼠脾臟T淋巴細胞增殖降低、CD8+細胞減少IFN-γ和TNF-α表達，出現免疫力降低[15-16]。CD4+CD25+T細胞和CD8+CD25+T細胞只有表達Foxp3后獲得抑制功能[17]，而單純CD4+CD25+T細胞和CD8+CD25+T細胞僅僅是輔助和抑制或殺傷功能細胞。本研究發現大鼠熱應激CD4+CD25+T細胞和CD4+CD25+Foxp3+細胞表現不盡相同，大鼠CD4+CD25+Treg細胞在37 ℃飽和濕度(100%)熱應激1～48 h顯著下降，增殖受到明顯抑制，即使T淋巴細胞刺激劑Con-A刺激也不能改變抑制狀態，更不用說LPS無關刺激；而CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞在1～48 h 之內并不降低，其中12 h時間點在非刺激和Con-A刺激組仍顯著升高，這種現象反映熱應激早期(1～48 h)機體出現相對免疫抑制狀態，將促進感染性疾病的發生；但是長期高溫濕熱應激(168 h)，CD4+CD25+Treg細胞在非刺激和Con-A刺激組恢復正常，LPS組甚至顯著高于正常對照(20 ℃)，事實上LPS能夠刺激DC促進CD4+T細胞增殖[18]；而CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞在168 h則較正常對照組顯著下降，這可能與熱應激激素下降有關，也許長期高溫濕熱容易導致免疫抑制減弱。

本研究還發現大鼠熱CD8+CD25+Treg細胞在37 ℃飽和濕度(100%)熱應激在非刺激、LPS刺激及Con-A刺激組1 h均顯著高于20 ℃組，慢慢下降直到48 h達最低，168 h又顯著升高，可能熱應激導致應激激素增加后出現機體炎性反應和細胞毒性作用，然后隨著機體免疫相對處于抑制狀態(CD4+CD25+Foxp3+細胞相對增加)，其CD8+增殖和活化受到抑制，但長期(168 h)高溫濕熱(100%)又顯著升高，可能與同期CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞降低，免疫抑制減弱相關，Con-A和LPS刺激也對CD8+CD25+Treg細胞無改變；而CD8+CD25+Foxp3+Treg細胞的表現與CD8+CD25+Treg細胞不一致，其在1 h和48 h顯著降低，12 h顯著升高，這可能與熱應激激素作用相關，也進一步證明CD8+CD25+Treg細胞被作用后12～48 h顯著降低，但長期(168 h)高溫濕熱(100%)CD8+CD25+Foxp3+Treg細胞在非刺激和LPS刺激組又顯著升高，其與CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞的下降產生互補，避免了免疫過強或變態反應發生，然而T細胞有絲分裂原Con-A刺激組則在長期高溫濕熱中CD8+CD25+Foxp3+Treg細胞并不增加，也許代表著T細胞在長期高溫濕熱中被抗原刺激容易導致免疫抑制減弱而出現免疫過強或變態反應發生。HENEKA等[6]證明，MOG(35-55)免疫接種小鼠2 d后開始熱應激，結果實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)的發病率減少了70%，且延遲發病，并發癥減輕，白細胞浸潤減少，CD4+CD25+T細胞減少，MOG(35-55)活化的T細胞也下降。

高溫濕熱應激機體CD4+CD25+Treg細胞及CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞與CD8+CD25+Treg細胞及CD8+CD25+Foxp3+Treg細胞的表現不相同，因為這兩大類細胞群體結構不同，功能作用方面也有差別，例如病毒感染高負荷時CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞也高，而CD8+CD25+Foxp3+Treg細胞則在病毒高峰后數天才出現[19]；與CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞不同的是CD8+CD25+Foxp3+Treg細胞主要通過接觸抑制[20]。CD4+CD25+Treg細胞與CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞，以及CD8+CD25+Treg細胞與CD8+CD25+Foxp3+Treg細胞的表現也不相同，其原因是CD4+CD25+Treg細胞和CD8+CD25+Treg細胞并不與抑制免疫反應相關，他們是正常活化的輔助和殺傷及細胞毒功能細胞，而CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞和CD8+CD25+Foxp3+Treg細胞才是抑制性Treg細胞。總之，在高溫濕熱應激中機體的免疫功能在早期有炎性因子產生和細胞殺傷導致炎性反應，而長時間持續高溫濕熱應激免疫抑制功能增強。

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