冬凌草甲素對小鼠潰瘍性結腸炎內質網應激的作用研究*

曾慶鐘，劉 穎，鄶一賀，劉敏鋒，易夢娟，王麗京，顧取良△

(廣東藥科大學：1.藥學院；2.基礎學院血管生物學研究所，廣州 510006)

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種病因和發病機制未明的炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)，以腹痛、腹瀉、里急后重和黏液膿血便等為主要癥狀，伴隨周期性結腸黏膜潰瘍、黏膜壞死和再生等病理學改變[1]。近年來，內質網應激(endoplasmic reticulum stress,ERS)在IBD發病過程中的重要作用受到很多研究關注[2-3]。冬凌草甲素是從我國傳統藥材冬凌草中提取出來的一種貝殼杉烯二萜類物質，具有多種藥理學活性，如抗炎、抗菌、抗氧化及抗腫瘤作用等[4]。研究發現冬凌草甲素片對醋酸誘導的小鼠UC具有防治作用，但缺少相應分子機制方面的研究[5]。本研究從ERS的角度探討冬凌草甲素對小鼠UC的防治效果及其作用機制。

表1 PCR引物序列

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 8周齡C57BL/6雄性小鼠40只，SPF級，體質量18～22 g，廣東省醫學實驗動物中心，許可證號：SCXK(粵)2013-0002。

1.1.2試劑與儀器 葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium salt，DSS)購自美國MP Biomedicals公司，冬凌草甲素購自中國生物藥品生物制品檢定所，柳氮磺胺吡啶購自美國Sigma公司，TRIzol購自美國Invitrogen公司，反轉錄試劑盒購自日本Takara公司，RT-qPCR引物由上海生工合成。實時熒光定量PCR儀為Roche公司 LightCycler?96型號。

1.2方法

1.2.1UC模型制備及藥物干預 將40只小鼠分為4組，即健康組(NOR)、模型組(DSS+生理鹽水)、冬凌草甲素干預組(DSS+冬凌草甲素)、柳氮磺胺吡啶干預組(DSS+柳氮磺胺吡啶)，每組10只。參照文獻[6]的方法建立急性UC模型，即配制2% DSS水溶液供除健康組以外的實驗小鼠自由飲用，連續飲用7 d，每2天更換1次新鮮DSS水溶液；健康組小鼠飲用正常無菌水。實驗期間每天灌胃給藥，冬凌草甲素劑量為15 mg·kg-1·d-1，柳氮磺胺吡啶劑量為500 mg·kg-1·d-1，模型組與健康組給予生理鹽水20 mL·kg-1·d-1。

1.2.2疾病活動指數(disease activity index，DAI)評分 實驗期間每天監測小鼠的體質量變化，觀察大便性狀，有無血便，有無隱血，按文獻[7]進行DAI評分。

1.2.3結腸病理觀察及組織病理形態學評分(histopathological score，HPS) 實驗第7天給藥2 h后麻醉條件下脫臼法處死小鼠，取小鼠結直腸，測量其長度。末端結直腸組織經4%多聚甲醛固定、脫水、石蠟包埋等常規程序后，組織切片進行蘇木素-伊紅(HE)染色。顯微鏡下觀察結腸組織病理形態并按文獻[6]進行病理評分。

1.2.4RT-qPCR法檢測結腸組織腸道上皮組織中相關因子的表達 分離各組小鼠的結腸上皮組織，用TRIzol試劑分別提取各組小鼠結腸上皮組織的總RNA并用紫外分光光度法測定純度與濃度。按照RT-qPCR試劑盒說明書操作，檢測腫瘤壞死因子-α(tumor factor-α,TNF-α)、白細胞介素-6(interkekin-6,IL-6)、環氧合酶-2(cyclooxygenase 2,COX-2)、葡萄糖調節蛋白78(proteins glucose-regulated protein 78 kD,GRP78)、轉錄因子EBP同源蛋白(C/EBP homology protein,CHOP)、激活性轉錄因子6(activating transcription factor 6,ATF6)、蛋白激酶R樣內質網激酶(PKR-like endoplasmic reticulum kinase,PERK)及肌醇酶1α(inositol requiring enzyme 1α,IRE1α)mRNA的表達。各指標RT-qPCR引物序列見表1。以GAPDH為內參，實驗獨立重復3次，采用2-ΔΔCt法分析數據。

2 結 果

2.1DAI評分及結直腸長度 與健康組比較，建模第7天時DSS誘導的模型組小鼠的體質量明顯下降，出現腹瀉、隱血或便血等典型UC癥狀，DAI評分明顯高于健康組(P<0.01)。與未經干預的模型組相比，冬凌草甲素干預組與柳氮磺胺吡啶干預組的UC癥狀均有所減輕，DAI評分明顯降低(P<0.01)，兩個藥物干預組之間DAI評分差異無統計學意義(P>0.05)。取結直腸測量其長度，模型組結直腸較健康組明顯縮短(P<0.01)，冬凌草甲素干預組與柳氮磺胺吡啶干預組能明顯減少結直腸縮短程度(P<0.05，P<0.01)，不過柳氮磺胺吡啶的效果更顯著，見圖1。

2.2結腸HPS 建模第7天取結直腸進行病理組織形態學觀察，健康組的結腸組織與腺體結構完整(圖2A)；模型組結腸黏膜則出現大量腺體溶解及大量的炎癥細胞浸潤，并伴有明顯的潰瘍(圖2B)；冬凌草甲素干預組與柳氮磺胺吡啶干預組結腸黏膜組織結構較為完整，有少量潰瘍，部分腺體溶解(圖2C和2D)。與健康組相比，模型組HPS明顯升高(P<0.01)；與模型組相比，冬凌草甲素干預組與柳氮磺胺吡啶干預組的HPS明顯降低(P<0.01)，且兩個藥物干預組之間HPS差異無統計學意義(P>0.05)，見圖2E。

2.3結腸上皮組織TNF-α、IL-6與COX-2 mRNA的表達變化 與健康組相比，模型組結腸上皮組織中TNF-α、IL-6及COX-2 mRNA表達水平均明顯上調(P<0.01)；與模型組比較，冬凌草甲素干預組TNF-α、IL-6及COX-2 mRNA表達水平均明顯下調(P<0.05或P<0.01)；盡管柳氮磺胺吡啶對COX-2 mRNA表達水平的影響更明顯(P<0.05)，但兩個藥物干預組之間TNF-α和IL-6 mRNA表達水平差異無統計學意義(P>0.05)，見圖3。

2.4結腸上皮組織GRP78、CHOP、IRE1α、ATF6與PERK mRNA的表達變化 與健康組相比，模型組結腸上皮組織中GRP78、IRE1α、PERK、ATF6及CHOP mRNA表達均明顯上調(P<0.05或P<0.01)；與模型組相比，冬凌草甲素干預組GRP78、ATF6、CHOP及PERK mRNA表達水平均明顯下調(P<0.05或P<0.01)，但IRE1α mRNA表達水平差異無統計學意義(P>0.05)，而較柳氮磺胺吡啶干預組IRE1α mRNA表達水平有明顯上調(P<0.01),見圖4。

a：P<0.05,b：P<0.01

圖1各組小鼠的DAI評分與結直腸長度

A：健康組；B：模型組；C：冬凌草甲素干預組；D：柳氮磺胺吡啶干預組；E：HPS；a：P<0.01

圖2結腸組織病理變化與HPS(HE×40)

a：P<0.05,b：P<0.01

圖3結腸上皮組織炎癥相關因子mRNA表達變化

a：P<0.05,b：P<0.01

圖4結腸上皮組織ERS相關因子mRNA表達變化

3 討 論

內質網是真核細胞中新生多肽折疊與組裝、蛋白質修飾與加工的重要場所，具有很強的適應性。研究表明，患有IBD的人類與動物的腸道上皮細胞中存在ERS，ERS激活的未折疊蛋白反應(UPR)對于維持腸道上皮細胞的正常形態與功能均很重要，但過度ERS會導致細胞啟動凋亡程序[2-3,8]。冬凌草甲素具有抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗氧化及免疫調節等作用[4]，近年亦有研究發現冬凌草甲素對肝癌HepG2細胞中ERS具有調節作用[9]。

本研究發現，冬凌草甲素干預DSS誘導的UC小鼠可使其結腸炎DAI評分和病理指標等明顯緩解，其療效與臨床上應用于UC的柳氮磺胺吡啶相當，且結腸上皮組織中炎癥相關因子TNF-α、IL-6和COX-2 mRNA表達亦明顯降低，提示冬凌草甲素可能通過其抗炎與免疫調節作用對UC結腸具有保護作用。

GRP78能通過與內質網中錯誤折疊或未折疊蛋白結合的方式來恢復異常蛋白質的正確構象，作為內質網主要分子伴侶對細胞起保護作用[10]。在應激發生時GRP78表達顯著增高，其表達水平在一定程度上反映細胞ERS的水平，可作為ERS的標志蛋白[11]。本研究發現，模型組小鼠結腸上皮組織中GRP78 mRNA表達水平較健康組有明顯上調，表明DSS誘導UC小鼠的結腸上皮組織中伴隨ERS發生，與文獻報道一致。在使用冬凌草甲素或柳氮磺胺吡啶干預時GRP78 mRNA表達水平明顯下降，并與健康組相當，一定程度上說明結腸上皮組織中ERS恢復到正常水平，提示冬凌草甲素能抑制UC小鼠ERS的作用。

IER1α、PERK和ATF6是哺乳動物的3種內質網跨膜蛋白，正常生理條件下與GRP78穩定結合，ERS發生時則與GRP78解離，引發UPR，發揮ERS狀態下的保護細胞功能，但這3種蛋白質也會介導細胞凋亡[2-3]。本研究中，模型組小鼠結腸上皮組織細胞中IRE1α、PERK及ATF6 mRNA的表達水平較健康組明顯上升，表明DSS誘導UC小鼠結腸上皮組織發生UPR；冬凌草甲素可以抑制其中PERK和ATF6 mRNA的表達升高，但對IRE1α mRNA卻沒有明顯影響，而柳氮磺胺吡啶對這3種ERS相關蛋白mRNA表達均有明顯下調作用。這一結果提示，盡管本研究中冬凌草甲素與柳氮磺胺吡啶防治UC療效相當，但從ERS角度來說二者的作用機制存在一定差異，而且目前關于柳氮磺胺吡啶在ERS方面的作用少有報道。冬凌草甲素干預未能降低IRE1α mRNA高表達，提示可能存在其他機制抑制了高水平IRE1α介導的細胞凋亡通路。有研究報道，IRE1α缺失會出現CHOP表達增加，因此IRE1α高表達亦可能抑制CHOP表達，二者之間的平衡保護細胞適度ERS[12]。

ERS雖然可以維持內質網穩態，但過強或過久ERS則會啟動細胞凋亡程序，CHOP則是其中的一條凋亡通道[13]，CHOP基因敲除小鼠在由三硝基苯磺酸誘導發生結腸炎過程中細胞凋亡減弱[14]。本研究中，DSS誘導的UC模型組小鼠結腸上皮組織中CHOP mRNA的表達水平較健康組明顯上調，與文獻[15]報道一致；使用冬凌草甲素干預則顯著降低增高的CHOP mRNA，表明冬凌草甲素將UC小鼠結腸上皮組織中ERS限制在適當程度內從而利于其發揮保護細胞作用。

綜上所述，冬凌草甲素可以抑制小鼠結腸上皮組織中炎癥相關因子表達，調控ERS，維持內質網穩定，這可能是冬凌草甲素防治UC的作用機制之一。目前國內外對冬凌草甲素在ERS方面作用的報道較少，因此仍需在動物水平和細胞水平上對其詳細作用機制進行進一步的研究。

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